張方亮，魏 悅，孫燕燕，何 新

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300742； 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

白芷為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch ex Hoffm) Benth et Hook f或杭白芷Angelicadahurica(Fisch ex Hoffm) Benth et Hook f varformosana(Boiss) Shan et Yuan的干燥根，性溫，氣芳香，味辛，微苦，具有散風(fēng)除濕、通竅止痛作用，用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻淵等[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白芷具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗病原微生物的作用[2]，能抑制銀屑病，治療白癜風(fēng)[3]，具有抗副交感神經(jīng)的作用，有解痙止痛效果[4]?！吨袊?guó)藥典》2015年版中29味成方藥物中有收載[5]。主要活性成分為香豆素類化合物，以歐前胡素(imperatorin)和異歐前胡素(isoimperatorin)的含量居高[6]，本試驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定血漿中7種香豆素(花椒毒酚、8-甲氧基-5-羥基補(bǔ)骨脂素、水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床夫內(nèi)酯、異歐前胡素、氧化前胡素)的含量，為白芷香豆素類化合物在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究提供參數(shù)依據(jù)。見圖1。

圖1 線型呋喃香豆素類化合物

1 材料

1.1儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，包括 Agilent 4212 二元泵、Agilent G1367E 標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent G1312B 二極管陣列檢測(cè)器及 G1322A柱溫箱(美國(guó) Agilent 公司)；高速離心機(jī)(型號(hào)：ALLEGRA-64R，美國(guó)BECKMAN公司)；分析天平(型號(hào)：MERRLER TOLEDO AX205，瑞士Mettler Toledo公司)；微型旋渦混合儀(型號(hào)：WH-3，上海滬西分析儀器廠有限公司)；氮?dú)獯蹈蓛x(型號(hào)：MTN-2800D，天津市奧特塞恩儀器有限公司)；微量移液器(eppendorf)。

1.2試藥 白芷香豆素提取物(實(shí)驗(yàn)室自制，采用大孔樹脂作為吸附劑，不同濃度乙醇作為洗脫劑，分離純化白芷總香豆素組分，測(cè)定含量為52.9%)；花椒毒酚、8-甲氧基-5-羥基補(bǔ)骨脂素、水合氧化前胡素、蛇床夫內(nèi)酯對(duì)照品(實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)MS、1H-NMR、13C-NMR檢測(cè)純度98%以上)；歐前胡素對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110826-201616)；異歐前胡素對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110827-201611)；佛手柑內(nèi)酯對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110825-201703 )；傘形花內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào) AB423U，含量99%，購(gòu)自天津一方科技有限公司)；羧甲基纖維素鈉(分析純，天津市生物化學(xué)制藥廠)；肝素注射液(1.25萬單位∶2 ml，天津市生物化學(xué)制藥廠)；甲醇為色譜純(天津美瑞泰克集團(tuán)有限公司)，乙酸乙酯等其他試劑均為分析純。

1.3動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，質(zhì)量(200±10) g，周齡6周，購(gòu)于北京稚通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK-(京)2016-0006。飼養(yǎng)于天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院藥物安全評(píng)價(jià)中心SPF級(jí)屏障區(qū)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～27 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，通風(fēng)次數(shù)為10～15次/h全新風(fēng)，12 h/12 h晝夜規(guī)律，自由飲食、飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理的相關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；流動(dòng)相A為甲醇，B為純水，梯度洗脫：0～30 min:35%→90% A，30.5 min:35% A，30.5～40 min：35% A；流速:1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：310 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取花椒毒酚、8-甲氧基-5-羥基補(bǔ)骨脂素、水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床夫內(nèi)酯、異歐前胡素7種對(duì)照品各5.0 mg，置5 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度約為1 mg/ml的對(duì)照品混合液，置冰箱(4 ℃)保存。精密稱取傘形花內(nèi)酯0.18 mg，用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中含有185 μg的溶液，置冰箱(4 ℃)保存。

2.2.2供試品溶液制備 精密稱定白芷總香豆素提取物溶于甲醇中，配成濃度為1 mg/ml混懸液，超聲溶解，備用。

2.2.3血漿樣品預(yù)處理 麻醉大鼠后腹主動(dòng)脈取血5 ml置于潤(rùn)有肝素的離心管中，3 000 r/min離心10 min，取上層血漿低溫保存。取100 μl空白血漿，加入10 μl甲醇，微型渦旋機(jī)渦旋1 min,用800 μl乙酸乙酯萃取，渦旋5 min，14 000 r/min、4 ℃離心5 min，取800 μl上清，N2吹干，100 μl甲醇復(fù)溶后，14 000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清20 μl進(jìn)樣。

2.3專屬性考查 取大鼠空白血漿樣品，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，獲得空白樣品的色譜圖(A)；將一定濃度的含7種香豆素的混合對(duì)照溶液及內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿，同法操作，獲得相應(yīng)色譜圖(B)；同法操作得白芷香豆素提取物色譜圖(C)。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)條件下，專屬性良好。見圖2。

A.傘形花內(nèi)酯 1.花椒毒酚 2.8-甲氧基-5-羥基補(bǔ)骨脂素 3.水合氧化前胡素 4.佛手柑內(nèi)酯 5.歐前胡素 6.蛇床夫內(nèi)酯 7.異歐前胡素

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性范圍的確定 取大鼠空白血漿100 μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μl，加入系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制成相當(dāng)于花椒毒酚、8-甲氧基-5-羥基補(bǔ)骨脂素、水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床夫內(nèi)酯、異歐前胡素濃度為20、10、4、2、0.8、0.4、0.16、0.08、0.032和0.016 μg/ml的10個(gè)樣品。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的典型直線回歸方程及線性范圍。7種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍見表1。

表1 白芷總香豆素提取物中7種成分線性范圍

2.5精密度考查 取含有花椒毒酚、5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素、水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床夫內(nèi)酯、異歐前胡素7種對(duì)照品混合溶液10 μl，加入到100 μl大鼠空白血漿中，乙酸乙酯萃取，N2吹干，100 μl甲醇復(fù)溶，離心，取上清連續(xù)進(jìn)樣6次。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)得峰面積。計(jì)算得到樣品中花椒毒酚RSD%為0.33%、5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素RSD為0.42%、水合氧化前胡素RSD為0.36%、佛手柑內(nèi)酯RSD為0.31%、歐前胡素RSD為0.22%、蛇床夫內(nèi)酯RSD為0.48%、異歐前胡素RSD%為0.36%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性考查 按“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法，稱取6份白芷總香豆素提取物溶于甲醇中，配成濃度為1 mg/ml溶液。取10 μl加入到100 μl大鼠空白血漿中，乙酸乙酯萃取，N2吹干，100 μl甲醇復(fù)溶，離心，取上清按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得峰面積。結(jié)果測(cè)得血漿中花椒毒酚平均濃度為1.914 μg/ml，RSD為0.45%；5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素平均濃度為2.076 μg/ml，RSD為0.38%；水合氧化前胡素平均濃度為2.241 μg/ml，RSD為0.42%；佛手柑內(nèi)酯平均濃度為1.063 μg/ml，RSD為0.69%；歐前胡素平均濃度為6.572 μg/ml，RSD為0.71%；蛇床夫內(nèi)酯平均濃度為7.144 μg/ml，RSD為0.48%；異歐前胡素平均濃度為3.884 μg/ml，RSD為0.29%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性考查 取“2.6”項(xiàng)下供試品溶液凍融3次后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算剩余百分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示花椒毒酚RSD為0.51%；5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素RSD為0.48%；水合氧化前胡素RSD為0.54%；佛手柑內(nèi)酯RSD為0.35%；歐前胡素RSD為0.26%；蛇床夫內(nèi)酯RSD為0.46%；異歐前胡素RSD為0.69%，表明供試品-20 ℃放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率考查 分別精密稱取花椒毒酚、8-甲氧基-5-羥基補(bǔ)骨脂素、水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床夫內(nèi)酯、異歐前胡素對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度分別為0.022 6 、0.022 6、0.022 6、0.011 2、0.062 4、0.071 2和0.042 2 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。精密稱定6份已知含量的白芷香豆素提取物供試品溶液及混合對(duì)照品溶液各10 μl加入到6份100 μl大鼠空白血漿中，混勻后乙酸乙酯萃取，N2吹干，100 μl甲醇復(fù)溶，離心，取上清按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果花椒毒酚的平均加樣回收率為 81.42%，RSD 為 0.310%；8-甲氧基-5-羥基補(bǔ)骨脂素的平均加樣回收率為 82.98%，RSD 為 0.378%；水合氧化前胡素的平均加樣回收率為 86.78%，RSD 為 0.449%；佛手柑內(nèi)酯的平均加樣回收率為 85.65%，RSD 為 0.519%；歐前胡素的平均加樣回收率為 84.37%，RSD 為 0.589%；蛇床夫內(nèi)酯的平均加樣回收率為 81.74%，RSD 為 0.530%；異歐前胡素的平均加樣回收率為 79.88%，RSD 為 0.529%，均符合生物制品提取回收率符合要求。見表2-8。

表2 花椒毒酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9樣品測(cè)定 精密稱取白芷香豆素提取物3 批樣品(A、B、C)，用甲醇配制成1 mg/ml溶液，取10 μl加入到100 μl大鼠空白血漿中，乙酸乙酯萃取，N2吹干，100 μl甲醇復(fù)溶，離心，取上清按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算得到提取物中7種香豆素成分含量，結(jié)果見表9。

表3 8-甲氧基-5-羥基補(bǔ)骨脂素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表4 水合氧化前胡素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表5 佛手柑內(nèi)酯加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表6 歐前胡素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表7 蛇床夫內(nèi)酯加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表8 異歐前胡素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表9 白芷總香豆素提取物中7種化合物的含量 mg/g

3 討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別取適量7種香豆素對(duì)照品，用甲醇溶解制備成溶液，進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，繪制紫外吸收光譜。其中波長(zhǎng)在310 nm左右，7種化合物的吸收波長(zhǎng)均較大，且此處內(nèi)源性物質(zhì)干擾少，故選擇310 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2流動(dòng)相的選擇 HPLC對(duì)流動(dòng)相的基本要求是:①不與固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；②對(duì)試樣有適宜的溶解度；③必須與檢測(cè)器相適應(yīng)；④純度要高，黏度要小。本試驗(yàn)考查了不同比例甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-水-冰醋酸的流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)的色譜圖[7，8]。結(jié)果表明，在梯度洗脫的條件下，流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)，白芷中主要化學(xué)成分都得到較好分離，且檢出峰數(shù)目最多，保留時(shí)間合適，峰形良好。

3.3內(nèi)標(biāo)物的選擇 內(nèi)標(biāo)物的選擇很重要，其選擇的基本原則是：①內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是試樣中不存在的純物質(zhì)；②加入的量應(yīng)該接近于被測(cè)組分；③內(nèi)標(biāo)物色譜峰位于被測(cè)組分色譜峰附近，或幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間，并與這些組分完全分離。本試驗(yàn)曾采用黃芩苷[9]作為內(nèi)標(biāo)物，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃芩苷在選定色譜條件下與樣品成分不能分離，無法用于含量測(cè)定。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，選用傘形花內(nèi)酯[10]作為內(nèi)標(biāo)物。試驗(yàn)結(jié)果表明，在上述色譜條件下，傘形花內(nèi)酯能與血漿中的雜質(zhì)及7種測(cè)定的香豆素成分完全分離，不干擾被測(cè)物質(zhì)的測(cè)定。

本試驗(yàn)采用了常見的C18柱，流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單，建立的測(cè)定各成分的HPLC法操作簡(jiǎn)便，而且靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性等均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定的要求。