張國文，石文麗，朱 苗

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

酪氨酸酶(Tyrosinase，TY)又稱多酚氧化酶，是黑色素合成和果蔬褐變的關鍵酶[1]，廣泛存在于動物、植物和微生物中。在哺乳動物體內，TY常見于黑色素細胞中，能催化產(chǎn)生黑色素，黑色素可以被分泌到表皮和毛發(fā)的角質細胞中，使其著色[2]。在人體內TY代謝異常則會引起部分色素沉著性皮膚病，如黃褐斑、雀斑、老年斑等，同時，還與人類的帕金森癥、黑色素瘤和白化病等疾病的發(fā)生與治療有直接關聯(lián)。

歐前胡素(Imperatorin，圖1)屬于6，7-呋喃香豆素類，在含有歐前胡素的植物中，傘形科植物的種類最多，包括蛇床子、白芷、防風等[3]。歐前胡素安全范圍較大、毒性較易控制[4]，主要代謝途徑為氧化代謝[5]，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤及逆轉腫瘤細胞耐藥性、治療心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等藥理作用[6]。

圖1 歐前胡素分子結構

20世紀80年代末以來，已發(fā)現(xiàn)大量自然來源的TY抑制劑，但大部分抑制劑由于安全性及穩(wěn)定性問題，而限制了其應用[7]，尋找天然、高效、安全的TY抑制劑在生物、醫(yī)學、農(nóng)學、藥學等多個學科和領域都具有重大意義。目前對歐前胡素藥理作用的研究大部分只停留在藥效層面或僅關注其對一個或某幾個信號通路的影響，在作用機制方面的研究尚不夠深入[6]。隨著對歐前胡素提取分離方法以及作用機制研究的深入，對于以歐前胡素為主要成分中藥的藥效的闡明以及新藥的研發(fā)將具有重要的意義[8]。胡大強等人[9]報道白芷提取物中主要含有歐前胡素，其對TY有抑制作用，而且其對TY的抑制活性較熊果苷更強。吳迪等[10]證明歐前胡素可以直接導致黑素瘤細胞凋亡、抑制TY活性或阻斷黑素合成，從而治療或預防黃褐斑。本文通過多種光譜學方法(紫外、熒光及圓二色光譜)并結合分子模擬技術,研究了歐前胡素體外抑制TY活性的分子機制，以期為歐前胡素作為食品功能因子研發(fā)提供一定的理論基礎和實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2450型紫外-可見分光光度計(日本，島津公司)；F-7000型熒光光度計(日本，日立公司)；MOS-450型圓二光譜儀(法國，Bio-Logic公司)；Millipore Simplicity水純化系統(tǒng)(法國，密理博司)；pHS-3C型PH酸度計(上海，雷磁)。

歐前胡素(上海安譜實驗科技股份有限公司，純度99.8%)；TY(Worthington Biochemical Corporation)；左旋多巴(南京奧多福尼生物科技有限公司；純度>98.0%)；歐前胡素用無水乙醇配成濃度為6.67×10-3mol·L-1的儲備液，TY、左旋多巴(L-dopa)和曲酸用磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.8，0.05 mol·L-1)分別配制成濃度為1.25×10-5mol·L-1，5.0×10-3mol·L-1(現(xiàn)配現(xiàn)用)和2.73×10-3mol·L-1的儲備液。其余試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 歐前胡素對酪氨酸酶的抑制活性測定

在總體積為2 mL，磷酸鹽(pH 6.8，0.05 mol·L-1)溶液為緩沖液的體系中，固定TY的濃度為1.25×10-7mol·L-1，加入一系列不同濃度梯度的歐前胡素，在30 ℃的條件下孵化1 h。孵化完成后，加入底物L-dopa(5.0×10-3mol·L-1)，用紫外-可見分光光度計的時間動力學模塊測定反應體系在200s內475 nm處的吸光度值，再通過公式(1)計算出不同濃度歐前胡素存在下TY的相對活性，并計算歐前胡素的半抑制濃度(IC50)。曲酸作為陽性對照。R0、R分別表示無抑制劑和含有不同濃度抑制劑反應體系的吸光度變化率。

相對酶活性(%)=(R/R0)×100%

(1)

1.2.2 歐前胡素對酪氨酸酶的抑制可逆性測定

固定底物L-dopa的濃度為5.0×10-4mol·L-1，進行4組實驗，測定在不同濃度歐前胡素的體系中，酶促反應速率(ΔOD)隨TY濃度增大的變化趨勢，再根據(jù)實驗數(shù)據(jù)作出ΔOD與TY濃度的關系圖，從而分析歐前胡素對TY的抑制作用是否可逆。若四條直線均交于原點，則說明抑制作用可逆；若四條直線互相平行，說明抑制作用不可逆。

1.2.3 判斷歐前胡素對酪氨酸酶的抑制類型

在與1.2.2相同的實驗條件下，另設4組實驗，固定TY的濃度為1.25×10-7mol·L-1，分別加入不同濃度的歐前胡素，測定反應體系中ΔOD隨底物L-dopa濃度增加的變化趨勢，再根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，分析歐前胡素對TY的抑制類型。

1.2.4 熒光光譜的測定

(1) 熒光猝滅實驗

將熒光光譜的實驗條件設置為：激發(fā)波長280 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm，掃描范圍300～450 nm。在1 cm的熒光池中，加入3.0×10-6mol·L-1的TY溶液3 mL，測定其熒光光譜后，再逐次加入3.0×10-4mol·L-1的歐前胡素，每次20 μL，混合均勻后靜置2 min，分別掃描25 ℃，31 ℃和37 ℃ 3個溫度下反應體系的熒光光譜。為了扣除“內濾光效應”的影響，本實驗的熒光數(shù)據(jù)均要經(jīng)過公式(2)進行校正[11]。Fm和Fc分別是校正前后的熒光強度；A1、A2分別表示歐前胡素在激發(fā)和發(fā)射波長處的紫外吸收值。

FC=Fme(A1+A2)/2

(2)

(2) 同步熒光光譜的測定

在25 ℃的條件下，設置實驗激發(fā)和發(fā)射波長的差值(Δλ=λem-λex)分別為15和60 nm，與熒光猝滅實驗一樣，逐次加入20 μL的歐前胡素，測定反應體系在230～350 nm的同步熒光光譜，分析歐前胡素對TY中酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基微環(huán)境的影響。

(3) 三光維熒光譜的測定

設置三維熒光光譜的實驗條件為：激發(fā)波長280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm，掃描范圍200～600 nm。固定反應體系的總體積為2 mL，TY的濃度為2.0×10-5mol·L-1，歐前胡素的濃度為3.0×10-3mol·L-1，再分別掃描TY和歐前胡素-TY復合物的三維熒光光譜。

1.2.5 圓二色(CD)光譜實驗

設置實驗掃描范圍為190～250 nm，掃描速度為60 nm min-1，并固定體系中TY的濃度為2.0×10-6mol·L-1，掃描歐前胡素與TY摩爾比分別為0:1、4:1和8:1時體系的CD光譜，再根據(jù)在線程序軟件計算得出TY二級結構(α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲)的含量，從而分析歐前胡素對TY二級結構的影響[12]。

1.2.6 分子模擬

運用Discovery Studio 4.5軟件中的LibDock對接程序進行歐前胡素與TY的分子對接模擬。TY的晶體結構從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB，http://www.rcsb.org/，ID：2Y9X)獲得。根據(jù)TY特殊的四聚體結構，選擇A鏈進行對接仿真優(yōu)化，然后進行氫化和極性加成操作。歐前胡素的結構從PubChem數(shù)據(jù)庫中檢索。歐前胡素系統(tǒng)的分子對接采用CDOCKER程序，運行次數(shù)為100次，選取最優(yōu)的歐前胡素-TY配合物的結合姿態(tài)進行對接分析。

2 結果與討論

2.1 歐前胡素對酪氨酸酶的抑制活性的測定

由圖2可知，隨著歐前胡素濃度的增加，TY的相對活性逐漸下降，當歐前胡素的濃度達到1.5×10-4mol·L-1，TY的相對活性降為31.16%，表明歐前胡素明顯抑制了TY的活性，且屬于濃度依賴型。同時，由圖可求出歐前胡素的IC50為7.90×10-5mol·L-1，陽性對照(曲酸)的IC50為4.03×10-5mol·L-1，說明歐前胡素對TY活性有較好的抑制效果。

[I]/(10-5 mol·L-1)

2.2 歐前胡素對酪氨酸酶的抑制可逆性分析

由圖3可知，隨著歐前胡素濃度的增加，ΔOD與TY濃度關系擬合直線的斜率不斷減小，且四條擬合直線均交于原點，說明歐前胡素能使TY催化速率下降，但不能使TY失活，由此判斷出歐前胡素對TY的抑制作用是可逆的。

[Tyrosinase]/(10-8 mol·L-1)

2.3 歐前胡素對酪氨酸酶的抑制類型分析

由圖4可知，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，可以得到一組線性關系良好的擬合直線，該組直線交于第二象限，且隨著歐前胡素濃度不斷增大，Km值不斷增大，Vmax值不斷減小，由此推測出歐前胡素對TY的抑制類型為混合型抑制[13]，其雙倒數(shù)方程[14]如下：

(3)

(4)

(5)

式中，ν為酶促反應速率，Km為米氏常數(shù)，Vmax為最大酶促反應速率，[I]表示歐前胡素的濃度，[S]表示底物L-dopa的濃度，Ki為抑制常數(shù)，α為表觀系數(shù)。

用直線斜率和截距分別對歐前胡素濃度作圖，線性關系良好(R2(Y-intercept)=0.987 9，R2(slope)=0.997 3)，表明歐前胡素與TY有一個結合位點，再通過計算得出歐前胡素對TY的Ki為7.54×10-5mol·L-1，α為2.88，α>1，說明歐前胡素與游離TY的結合親和力較強[15]。

c(TY)=1.25×10-7 mol·L-1，c(Imperatorin)=0，3.75，7.5 and 11.25×10-5 mol·L-1for curve a→d，respectively.

2.4 歐前胡素對酪氨酸酶熒光光譜的影響分析

2.4.1 猝滅機制、結合常數(shù)、結合位點數(shù)以及熱力學分析

如圖5(A)所示，隨著歐前胡素濃度的增大，TY的熒光強度不斷下降，說明歐前胡素猝滅了TY的內源熒光，此外，歐前胡素的加入還引起了TY的熒光峰位紅移，表明歐前胡素與TY發(fā)生了相互作用。再根據(jù)Stern-Volmer方程[16]進一步分析歐前胡素對TY的熒光猝滅機制；

(6)

式中，F(xiàn)0和F分別為歐前胡素加入前后TY的熒光強度；[Q]為歐前胡素的濃度；Ksv為猝滅常數(shù)；Kq為猝滅過程中的速率常數(shù)；τ0代表無猝滅劑時熒光分子的平均壽命，其值約為10-8s[17]。

λ/nm

[Imperatorin]/(10-6 moL·L-1)

通過F0/F對[Q]作圖，得出3個溫度(25 ℃，31 ℃和37 ℃)下的猝滅常數(shù)Ksv(表1)，雖然隨著溫度升高，Ksv值增大，但是Kq遠大于2×1010L·mol-1·s-1(最大擴散碰撞猝滅速率常數(shù))，表明歐前胡素對TY的熒光猝滅機制屬于靜態(tài)型。

(7)

[Qt]為歐前胡素的濃度，[Pt]為TY的濃度。由表1可知，Ka在104數(shù)量級，說明歐前胡素對TY有中等強度的結合親和力。在25 ℃，31 ℃，37 ℃ 3個溫度下，n值均約等于1，說明TY中僅有一個供歐前胡素結合的位點。熱力學參數(shù)可以通過van’t Hoff方程求出：

(8)

ΔG°=ΔH°-TΔS°

(9)

R是氣體常數(shù)(8.314 J·mol-1·K-1)，Ka為結合常數(shù)。從表1中可以看出，ΔG°<0，說明歐前胡素與TY的結合是自發(fā)進行的，ΔH°>0，ΔS°>0，說明疏水作用力在歐前胡素與TY結合的過程發(fā)揮了主要作用[19]。

表1 不同溫度下歐前胡素與TY作用的猝滅常數(shù)、結合常數(shù)、結合位點數(shù)與熱力學參數(shù)值

2.4.2 歐前胡素對酪氨酸酶的同步熒光光譜的影響分析

圖6分別表示Δλ為15和60 nm時歐前胡素與TY反應的同步熒光光譜。隨著加入的歐前胡素濃度的不斷增大，Tyr殘基(圖6A)和Trp殘基(圖6B)的熒光發(fā)射峰強度不斷降低，峰位無明顯的移動，說明歐前胡素的加入對Tyr和Trp殘基周圍微環(huán)境幾乎不造成影響[20]。由同步熒光猝滅比率(RSFQ=1-F/F0)與歐前胡素濃度關系圖(圖6C)可知，Δλ=15 nm時歐前胡素的RSFQ值始終大于其在Δλ=60 nm時的值，說明Tyr對TY的熒光猝滅貢獻更大，并且Tyr殘基更靠近結合位點。

λ/nm λ/nm[Imperatorin]/(10-6 moL·L-1)

2.4.3 三維熒光光譜分析

圖7(A)是TY的三維熒光光譜，Peak a和Peak b分別表示瑞利散射峰(λex=λem)和二階散射峰(λex=2λem)，Peak 1(λex/λem=280 nm/340 nm)表示Tyr和Trp殘基的熒光特征峰，Peak 2(λex/λem=230 nm/335 nm)是TY多肽主鏈結構n→π*躍遷引起的。與熒光光譜圖(A)相比，添加歐前胡素后，熒光光譜圖(B)中Peak a熒光強度明顯增加，Peak b熒光強度稍有減弱，表明歐前胡素與TY結合形成歐前胡素-TY復合物，從而增強了瑞利散射。Peak 1的熒光強度下降了12.09%，峰位未改變，表明Tyr和Trp殘基的微環(huán)境幾乎沒有受到歐前胡素的干擾，這與同步熒光的結果一致。Peak 2的熒光強度下降了21.82%，表明歐前胡素-TY復合物的形成改變了TY的多肽主鏈結構，詳細數(shù)據(jù)列于表2中。

圖7 游離TY(A)和TY-歐前胡素體系(B)的三維熒光光譜

表2 游離TY和TY-歐前胡素體系的三維熒光光譜值

2.5 歐前胡素對TY的CD光譜的影響分析

圖8為不同濃度的歐前胡素與TY作用的CD光譜，由圖可知，TY在210～230 nm內可以依稀辨認出兩個負峰，但是歐前胡素在此范圍內無明顯的特征光譜峰，且隨著歐前胡素濃度增大，CD特征光譜有一定的變化。通過在線軟件計算出TY的二級結構含量，結果列于表3中，與游離的TY二級結構相比，加入歐前胡素后([歐前胡素:TY]=4:1和8:1)，TY的α-螺旋含量有明顯的降低，從43.6%降至34.7%，而β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲含量有一定程度上升，表明歐前胡素使TY的結構變得松散且更不穩(wěn)定。

λ/nm圖8 歐前胡素對TY的CD光譜的影響

表3 TY和TY-歐前胡素體系的二級結構含量

2.6 分子模擬分析

圖9(A)展示了歐前胡素與TY對接后的最佳結合位置，歐前胡素插入了TY的活性中心，并與周圍的氨基酸殘基發(fā)生了相互作用。由圖(B)可知，歐前胡素通過疏水作用力與氨基酸殘基His244、Val283、Val286、His263相互作用，并通過范德華力與Val248、Phe264、Gly281等氨基酸殘基相互作用，表明歐前胡素與TY的結合除了受疏水相互作用

圖9 (A)歐前胡素與TY最佳結合姿態(tài)的空間結構圖(B)TY中與歐前胡素相互作用的氨基酸殘基的2D結構圖

驅動外，還存在一定程度的范德華力，這與熱力學實驗結果一致。通過分子模擬結果推測歐前胡素對TY的抑制作用可能是因為歐前胡素占據(jù)了TY的活性位點，阻止了底物與活性中心結合，從而導致TY催化活性下降。

3 結論

歐前胡素對TY有良好的抑制作用，是一種可逆的混合型TY抑制劑，且更傾向于與游離的TY結合。歐前胡素對TY是靜態(tài)型猝滅，兩者有一個結合位點。結合過程是自發(fā)進行的，主要驅動力為疏水作用力。歐前胡素的加入對Tyr和Trp殘基周圍的微環(huán)境基本上不造成影響，但使TY的二級結構變得松散，主要表現(xiàn)在α-螺旋含量明顯下降，而β-折疊、β-轉角、無規(guī)則卷曲含量有一定程度上升。分子模擬結果顯示歐前胡素插入到TY的活性中心，通過疏水力與氨基酸殘基His244、Val283、Val286、His263相互作用。因此推測歐前胡素對TY的抑制作用可能是因為歐前胡素占據(jù)了TY的活性中心位點，阻止底物與活性中心結合，從而抑制了TY催化活性。