賈立濤 姚琳 劉延群 張沛靈 劉豫 曹誼林 周廣東

軟骨缺損在臨床上十分常見，由于成熟軟骨沒有血管、神經(jīng)組織和淋巴管，一旦損傷，其自我修復(fù)極為困難[1]。利用組織工程技術(shù)修復(fù)和替代受損軟骨組織是解決這一難題的理想手段[2-3]。軟骨組織工程包括種子細(xì)胞、支架材料和調(diào)節(jié)信號(hào)[4]。其中，支架材料，特別是三維多孔支架，作為種子細(xì)胞臨時(shí)生長的微環(huán)境，為細(xì)胞輸送營養(yǎng)物質(zhì)和排出代謝廢物，在軟骨組織再生中具有重要作用[5-6]。

軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)（Acellular cartilage matrix，ACM）作為天然可降解材料，生物相容性好，免疫原性低，并且軟骨基質(zhì)成分可提供軟骨再生微環(huán)境，促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌和軟骨形成，被認(rèn)為是最理想的軟骨組織工程支架材料[7-9]。本研究將軟骨組織徹底粉碎后進(jìn)行脫細(xì)胞處理，制成軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)粉末，復(fù)合一定比例的明膠（Gelatin，GT）提升交聯(lián)性能[10]，經(jīng)冷凍干燥后制成三維多孔支架；隨后復(fù)合豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，體外成軟骨培養(yǎng)8 周，以期能構(gòu)建具有較成熟軟骨組織形態(tài)的組織工程軟骨。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

高糖DMEM 培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B（Gibco，美國）；胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（Hyclone，美國）；膠原酶、抑肽酶、核酸酶、Tris-HCL、Triton X-100（Sigma，美國）。

SEM（Philips XL-30，荷蘭）；生物力學(xué)分析儀（Instron，美國）；真空冷凍干燥機(jī)（上海億倍實(shí)業(yè)有限公司）；全自動(dòng)冷凍研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1 周齡新生小豬1 只（上海甲干生物科技有限公司）。本實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則。

1.3 新生小豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的獲取

無菌條件下切取新生小豬關(guān)節(jié)軟骨組織，切成1～2 mm3小塊，置于含0.15%膠原酶的培養(yǎng)基（DMEM）中，37 ℃搖床中消化過夜（100 r/min，8～10 h）。將收獲的軟骨細(xì)胞接種到含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B 的DMEM 培養(yǎng)皿（10 cm）中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取第2 代軟骨細(xì)胞備用。

1.4 軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)粉末的制備

當(dāng)?shù)赝涝讏霁@取新鮮牛肩胛軟骨組織，剔除表面多余組織和筋膜，獲得透明軟骨片。將樣品浸入液氮中5 min，經(jīng)冷凍研磨成軟骨粉末，隨后進(jìn)行脫細(xì)胞處理：①0.5%胰蛋白酶/PBS 溶液（w/v）37 ℃恒溫震蕩24 h，每4 h 更換新的胰蛋白酶溶液；②核酸酶溶液（50 U/mL 脫氧核糖核酸酶、1 U/mL 核糖核酸酶A，溶于10 mM Tris-HCL 中，pH=7.5）37 ℃攪拌4 h；③10 mM Tris-HCL（含10 U/mL 抑肽酶）37 ℃震蕩20 h；④1% Triton X-100/PBS 溶液（v/v）37 ℃震蕩24 h；⑤PBS 溶液洗滌6 個(gè)循環(huán)，每次2 h。最后經(jīng)冷凍干燥制成脫細(xì)胞基質(zhì)粉末，干燥箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 不同ACM/GT 比例三維多孔支架的制備

取適量的ACM 和GT，分別用去離子水配制成濃度為1%的懸濁液，GT 需37 ℃震蕩1 h 溶解。取ACM 懸濁液和GT 溶液按不同體積比（ACM:GT 分別為1:9、3:7、5:5、7:3 和9:1）震蕩混勻，分別注入特制的模具中，冷凍干燥后與EDC 交聯(lián)，制成8 mm直徑、2 mm 厚的圓柱狀多孔支架，大體觀察、掃描電鏡拍照，環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.6 不同ACM/GT 比例多孔支架的材料表征分析

1.6.1 孔徑大小的分析

通過Image-J 軟件分析5 組不同ACM/GT 比例多孔支架的SEM 圖片，分別選取不同視野的100 個(gè)孔隙測量孔徑大小，每組測量3 個(gè)平行樣品。

1.6.2 孔隙率的分析

分別稱量5 組樣品干態(tài)時(shí)的質(zhì)量M0，將支架浸入無水乙醇2 h 后再次稱量支架的質(zhì)量M1，孔隙率P=（M1-M0）/ρ 乙醇V 支架×100%。其中，ρ 為無水乙醇的密度。每組測量3 個(gè)平行樣品。

1.6.3 生物力學(xué)測試

5 組樣品分別置于生物力學(xué)分析儀上，沿垂直支架方向以1 mm/min 的速度壓縮，直到支架破碎。記錄力與位移曲線，計(jì)算楊氏模量。每組測量3 個(gè)平行樣品。

1.6.4 體外降解實(shí)驗(yàn)

分別稱量5 組樣品干態(tài)時(shí)的質(zhì)量W0，然后分別放入含有10 mL PBS（pH=7.4）的離心管中，37 ℃搖床、100 r/min 震蕩，分別在1、2、4 周時(shí)將支架取出，去離子水浸泡沖洗，冷凍干燥后稱重并記錄干態(tài)下質(zhì)量W1，計(jì)算支架在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)的質(zhì)量剩余百分?jǐn)?shù)（W1/W0×100%），每組測量3 個(gè)平行樣品。

1.7 細(xì)胞支架復(fù)合物的制備

取第2 代軟骨細(xì)胞，制成1×108cells/mL 的細(xì)胞混懸液，均勻接種于已消毒的多孔支架上，37 ℃、5%CO2、飽和濕度下靜置4 h，添加培養(yǎng)基后體外培養(yǎng)8 周，每兩天換液1 次。

1.8 組織學(xué)檢測

大體觀察體外培養(yǎng)2、4、6、8 周的標(biāo)本。另取體外培養(yǎng)4 周和8 周的標(biāo)本，4%多聚甲醛固定48 h，脫水、石蠟包埋，切片（厚度為5 μm），HE 染色及Safranin-O 染色，觀察組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況；免疫組織化學(xué)方法檢測Ⅱ型膠原的表達(dá)情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 軟件（Version 7.0，美國）行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用One-Way ANOVA，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACM 多孔支架的制備

本研究制備ACM 多孔支架主要分為兩個(gè)步驟：①制備ACM 粉末；②復(fù)合GT 溶液制備三維多孔支架。新鮮軟骨組織經(jīng)低溫研磨、脫細(xì)胞處理和冷凍干燥制備ACM 粉末（圖1A-D）；復(fù)合一定比例GT 溶液經(jīng)冷凍干燥和EDC 交聯(lián)制備三維多孔支架（圖1E-H）。

2.2 不同ACM/GT 比例多孔支架的制備

不同比例多孔支架形狀規(guī)整，表面粗糙，直徑約8 mm，厚度2 mm；大體外觀無明顯差別；支架表面電鏡掃描顯示，多孔支架的孔隙分布均勻，孔徑大小維持在100～300 μm 之間（圖2）。

2.3 不同ACM/GT 比例多孔支架的表征分析

不同ACM/GT 比例多孔支架的孔徑大小維持在100～300 μm 之間，隨著ACM 含量的增加，支架平均孔徑呈逐漸增大趨勢(shì)（圖3A）；5 組多孔支架孔隙率均大于85%，隨著ACM含量的增加，支架孔隙率逐漸增大，但同時(shí)力學(xué)強(qiáng)度逐漸降低（圖3B、C）；5 組支架在降解第1、2 周時(shí)剩余質(zhì)量均維持在90%左右，第4 周時(shí)，其中4 組支架（1:9，3:7，5:5，7:3）剩余質(zhì)量在75%左右，而9:1 組剩余質(zhì)量僅為50%，且部分支架已碎裂（圖3D）。

5 組多孔支架中，5:5 組孔徑（170 μm、孔隙率86%，適宜體外軟骨再生，因此我們選取此組多孔支架用于軟骨體外構(gòu)建。

2.4 體外構(gòu)建軟骨大體觀察

細(xì)胞支架復(fù)合物體外培養(yǎng)2 周時(shí)，大體觀察顯示軟骨細(xì)胞在支架表面均勻分泌基質(zhì)，邊緣已有新生軟骨組織形成，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，成軟骨效果逐漸明顯；第8 周時(shí)已具有明顯的軟骨組織特征，且有較好的彈性和韌性（圖4）。

2.5 組織學(xué)觀察

體外培養(yǎng)第4 周時(shí)，HE 和Safranin-O 染色顯示，已有大量軟骨細(xì)胞外基質(zhì)和均勻的特異性軟骨陷窩形成，Ⅱ型膠原免疫組化進(jìn)一步證明了所構(gòu)建的組織為均勻的軟骨組織（圖5）。第8 周時(shí)，組織學(xué)觀察顯示，軟骨陷窩成熟度增加，體外再生軟骨質(zhì)量進(jìn)一步提高（圖6）。

圖1 ACM 多孔支架制備Fig.1 Preparation of ACM porous scaffolds

圖2 不同ACM/GT 比例多孔支架的大體觀及電鏡圖Fig.2 Preparation of scaffolds with different ACM/GT ratios

圖3 不同ACM/GT 比例多孔支架表征分析（*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001）Fig.3 Characterization analysis of scaffolds with different ACM/GT ratios (*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001)

圖4 體外構(gòu)建軟骨大體觀察Fig.4 Gross observation of cartilage constructed in vitro

圖5 體外培養(yǎng)4 周組織學(xué)觀察Fig.5 Histological observation after cultured for 4 weeks in vitro

圖6 體外培養(yǎng)8 周組織學(xué)觀察Fig.6 Histological observation after cultured for 8 weeks in vitro

3 討論

軟骨組織工程可再生具有正常生物學(xué)功能的自體軟骨組織[11]，為臨床治療軟骨缺損提供了新的思路[2-3]。支架材料是組織工程的三要素之一，是種子細(xì)胞代謝活動(dòng)的場所和連接細(xì)胞與組織的橋梁，在軟骨組織工程中具有重要的作用。理想的軟骨組織工程支架需滿足以下要求[12-14]：①生物相容性好、免疫原性低；②合適的孔徑大小和孔隙率；③有一定的力學(xué)強(qiáng)度，可維持細(xì)胞的三維生長；④降解速率適中，適配軟骨再生的速率；⑤可模擬軟骨微環(huán)境，促進(jìn)體內(nèi)、外構(gòu)建軟骨。

脫細(xì)胞基質(zhì)是理想的支架材料來源[15]，在心臟瓣膜、真皮、膀胱、血管和肝臟等組織器官的構(gòu)建中均已廣泛應(yīng)用[16-19]。然而，由于軟骨組織非常致密，很難徹底脫凈細(xì)胞，而殘留細(xì)胞可能導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，因此ACM 的應(yīng)用受到限制。研究表明，將軟骨組織切成10 μm 薄片后再行脫細(xì)胞處理，可有效解決細(xì)胞殘留問題[20]。但是，這些薄片無法制成多孔支架，難以復(fù)合細(xì)胞且不易加工塑形，不適宜三維多孔支架的制備。另有研究表明，應(yīng)用CO2激光打孔技術(shù)在氣管軟骨表面打出點(diǎn)陣排列的激光微孔，可有效增加氣管基質(zhì)與脫細(xì)胞液體的接觸面積，使脫細(xì)胞過程更加快速徹底[21]，但是激光微孔結(jié)構(gòu)并不利于種子細(xì)胞的黏附和增殖，難以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效的組織再生。本研究將軟骨組織徹底粉碎后再行脫細(xì)胞處理，有效解決了脫細(xì)胞及免疫原性的難題。但是，ACM 粉末塑形困難，無法制成三維多孔支架。因此，我們以一定比例的GT 溶液作為輔劑，有效提升了ACM 交聯(lián)性能，經(jīng)冷凍干燥和EDC 交聯(lián)，成功制備了基于ACM 的三維多孔支架，證實(shí)了ACM 制備三維多孔支架的可行性。我們還發(fā)現(xiàn)三維多孔支架的孔徑、孔隙率與材料復(fù)合比例及凍干參數(shù)密切相關(guān)，而支架降解速率則與交聯(lián)參數(shù)有關(guān)，這為我們研制孔徑、孔隙率、降解速率均適合軟骨再生的三維多孔支架提供了解決思路。

本研究將細(xì)胞-ACM 支架復(fù)合物體外培養(yǎng)8周，驗(yàn)證了ACM 體外再生軟骨的可行性。組織學(xué)觀察顯示，細(xì)胞-ACM 支架復(fù)合物可體外再生均質(zhì)、典型的軟骨組織。這可能得益于①三維多孔支架的建立，有利于營養(yǎng)交換和物質(zhì)運(yùn)輸，同時(shí)使軟骨細(xì)胞在支架表面及內(nèi)部均勻分布，促進(jìn)了相對(duì)均質(zhì)的軟骨再生；②ACM 保留了軟骨組織的天然成分，如Ⅱ型膠原、糖胺多糖等，為軟骨再生提供了理想的微環(huán)境，促進(jìn)了軟骨細(xì)胞基質(zhì)分泌和軟骨形成[16]；③ACM提供了一些生長因子，如TGF-β、IGF 等，促進(jìn)了軟骨分化和成熟[17-18]。

綜上所述，ACM 可制成適宜軟骨再生的三維多孔支架，并可在體外成功構(gòu)建組織工程軟骨，是一種理想的軟骨組織工程支架。今后，我們將系統(tǒng)地調(diào)控材料復(fù)合比例及濃度、凍干、交聯(lián)參數(shù)，以精準(zhǔn)控制孔徑、孔隙率及降解速率，并結(jié)合3D 打印技術(shù)，實(shí)現(xiàn)支架三維形態(tài)的精確控制，滿足臨床患者需要的個(gè)性化定制組織工程軟骨，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。