王學(xué)麗 李婭茹 王夢夢 丁 婕 盧 瑛

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室,上海 201306)

食物過敏是食品安全領(lǐng)域的一個重要問題，世界衛(wèi)生組織(WHO)已將食物過敏視為第四大最關(guān)鍵的公共衛(wèi)生問題，研究報道全世界有高達(dá)10%的人口患有食物過敏[1]。以蝦為代表的水產(chǎn)甲殼類是FAO確定的八大類致敏食物之一[2]。蝦、蟹等甲殼動物是最常見的由IgE介導(dǎo)引起的過敏食物[3]，約有20%的過敏患者對蝦過敏，小兒發(fā)病率高達(dá)60%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[4]。水產(chǎn)食物過敏反應(yīng)存在免疫交叉性，過敏原蛋白是食物過敏反應(yīng)的主要誘因，但引起過敏反應(yīng)的不是整個蛋白，而是其中的抗原表位[5]，因而了解蝦過敏原及其抗原表位在人體內(nèi)的變化可以為脫敏食物的制備和治療蝦過敏提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

甲殼類的主要過敏原是原肌球蛋白TM[6-8]，占蝦和蟹過敏的80%[9]。該過敏原是具有α-螺旋卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)[10]，分子量35～38 kD[11,12]。近些年，TM的表位信息也逐漸明確，Shanti等[13]利用抑制性ELISA和Western blot分析表明，印度對蝦(Penaeusindicus)的TM被胰蛋白酶降解產(chǎn)生的肽段(AA:50～66，153～161)有免疫活性，確定其為線性表位。Ayuso等[14]通過交疊肽合成法，并結(jié)合蝦過敏患者血清，發(fā)現(xiàn)TM的8個線性抗原表位。Zheng等[15]通過生物信息學(xué)方法預(yù)測出斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)TM的10個線性表位，并利用抑制性Dot-blot檢測出8個線性表位。周瑾茹[16]通過生物信息學(xué)方法并結(jié)合間接競爭ELISA檢測出南美白對蝦(LitopenaeusVannamei)8個線性表位。食物過敏通常發(fā)生在人體攝入過敏原后，人體消化系統(tǒng)會影響過敏原的結(jié)構(gòu)和表位，從而引起過敏原及其抗原表位的致敏性的變化[5]。劉光明等[17]發(fā)現(xiàn)模擬胃液消化(Simulated gastic fluid，SGF)15 min后鯉魚膠原蛋白明顯降解，由于抗原表位的存在，消化1 h后仍具有一定的免疫原性。趙鑫等[5]發(fā)現(xiàn)TM經(jīng)SGF消化后，免疫原性降低，降解產(chǎn)生一些較穩(wěn)定的蛋白片段，但仍具有致敏性。

為了分析體外模擬胃液消化對蝦中主要過敏原TM抗原表位的影響，本研究以南美白對蝦的主要過敏原TM為研究對象，采用體外模擬胃液消化和質(zhì)譜分析，探討了消化過程中TM抗原表位的變化狀況。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 新鮮的南美白蝦購于當(dāng)?shù)夭耸袌觯晃傅鞍酌?P700-25G)、豬胃黏蛋白(M2378-100G)：美國Sigma公司；蛋白質(zhì)Marker(14.4～116 kD)和蛋白質(zhì)Marker(10～170 kD)：美國Thermo公司；Tris-MOPS-SDS電泳緩沖液、12%預(yù)制膠：美國GenScript公司；R-250考馬斯亮藍(lán)染色液、2×上樣緩沖液(Loading Buffer)、HRP-羊抗鼠IgG：生工(上海)股份有限公司；一抗5G5E：實驗室自制；PVDF膜(0.45 μm)：美國Millipore公司；脫脂奶粉：美國BD公司；DAB顯色液(D0426-50SET)：美國Sigma公司；其他試劑和藥品：國藥，分析純。

1.1.2儀器與設(shè)備 JYL-C020勻漿機(jī)；08-2G恒溫磁力攪拌器；LX-100手掌型離心機(jī)；eppendorf 5417R高速冷凍離心機(jī)；Sartorius PB-10 pH計；TS-110×30水浴恒溫?fù)u床；Bio-Rad電泳儀；Synergy 2酶標(biāo)儀；JY-ZY3半干式轉(zhuǎn)移電泳槽；LTQ Orbitrap Velos Pro質(zhì)譜儀。

1.2方法

1.2.1蝦主要過敏原原肌球蛋白富集液的制備 參照孫佳益等[18]的方法，并略有修改。將蝦去頭去殼去尾去蝦線，微波30 s，勻漿，把冷丙酮加入蝦肉中，攪拌抽提5次至丙酮溶液為無色，用紗布過濾，將沉淀物置于4℃空氣中風(fēng)干即為丙酮粉。按1∶10(W∶V)加入含0.5 mmol/L DTT的PBST緩沖液(含0.05%吐溫-20的20 mmol/L PBS)至丙酮粉中，勻漿，煮沸10 min，10 000 r/min 離心35 min后取上清。向所得上清液中加入硫酸銨，比例為45%(W∶V)，溶解所有硫酸銨，并以低速攪拌1 h。10 000 r/min離心35 min后收集沉淀。用超純水溶解，透析。將透析液冷凍干燥并儲存在-35℃冰箱中以備后用。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定采用BCA法，具體方法參照生工BCA定量試劑盒說明書。

1.2.2模擬胃液消化TM的試驗 人工胃液SGF配置參照美國藥典[19]。配好的SGF提前于37℃水浴振蕩，加入純化的TM(5 mg/ml)，在Hur等[20]的基礎(chǔ)上篩選酶與底物蛋白質(zhì)的比例，最終確定為1∶5(W/W)；按時間0、1、3、5、10、15、30、60、90和120 min 依次取出100 μl加入35 μl的終止液(0.2 mol/L Na2CO3)，使消化酶失活進(jìn)而中止消化反應(yīng)，并置于冰上。其中，0 min樣品是將SGF與終止液混合，終止反應(yīng)，然后加入一定量的底物。

1.2.3SDS-PAGE和Western blot 稀釋樣品后，加入2×上樣緩沖液并混合煮沸5 min。冰浴20 min后，取12%的預(yù)制膠，樣品上樣量8 μl。設(shè)置電源電壓進(jìn)行跑膠，待電泳結(jié)束后取出預(yù)制膠，染色2 h，脫色至蛋白質(zhì)條帶清晰。

轉(zhuǎn)移膠根據(jù)SDS-PAGE法制得，并將蛋白質(zhì)蛋白Marker(14.4～116 kD)改為蛋白質(zhì)Marker(10～170 kD)。設(shè)置半干式轉(zhuǎn)移電泳槽電流180 mA，時間20 min。用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后用PBST洗滌膜3次，每次5 min。PVDF膜用TM的特異性單抗5G5E(1 μg/ml)孵育1 h，洗滌。然后用HRP-羊抗小鼠IgG(1∶2 500)溶液孵育1 h，洗液洗滌。加入DAB工作液，顯色5 min，用去離子水洗去殘留顯色液并風(fēng)干，出現(xiàn)棕色條帶為陽性，及時封膜攝像。

1.2.4間接ELISA 用50 mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)將富集液TM稀釋至5 μg/ml，每孔加入100 μl，4℃過夜。PBST溶液洗滌3次，每次振蕩15 s(簡稱洗滌)。用5%(W∶V)脫脂奶粉37℃封閉 1 h，洗滌。然后，向每孔加入100 μl特異性單抗5G5E，37℃孵育1 h，洗滌。加入HRP-羊抗鼠IgG(100 μl/孔)，37℃孵育1 h，洗滌。加入OPD底物溶液，室溫孵育20 min，用2 mol/L硫酸50 μl/孔終止反應(yīng)，并使用酶標(biāo)儀立即測490 nm波長下的吸光值。以50 mmol/L的碳酸鹽溶液作為陰性對照，以抗體稀釋液稀釋的特異性抗體5G5E作為陽性對照，每個樣品做4個平行。樣品中TM的抑制率按照下述公式計算：

1.2.5模擬胃液消化TM后消化產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定 質(zhì)譜鑒定委托上海鹿明生物科技有限公司完成。酶解：蛋白質(zhì)酶解參考Katayama等[21]的方法進(jìn)行。質(zhì)譜鑒定：采用LTQ Orbitrap Velos Pro質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan)進(jìn)行質(zhì)譜分析，分析時長：105 min，檢測方式：正離子，噴霧電壓：1.8 kV，離子傳輸毛細(xì)管溫度：250℃，使用前經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)校正液校正，母離子掃描范圍：350～1 800 m/z。數(shù)據(jù)庫搜索：采用Mascot 2.3軟件(Matrix Science) 進(jìn)行，數(shù)據(jù)庫為南美白對蝦數(shù)據(jù)庫，酶為胰蛋白酶，允許最大漏切位點為2；固定修飾為：Carbamidomethyl (C)；可變修飾為：Acetyl (Protein N-term)、Deamidated (NQ)、Dioxidation (W)、Oxidation (M)；MS容差為±30 ppm，MSMS容差為±0.15 Da，Protein score C.I.%大于95%為鑒定成功。

2 結(jié)果

2.1南美白對蝦主要過敏原TM的富集和鑒定 南美白對蝦中的水溶性蛋白質(zhì)抽提液經(jīng)煮沸、硫銨濃縮處理后的SDS-PAGE結(jié)果如圖1A所示。對比電泳圖中的抽提液(樣品1)、煮沸處理樣品(樣品2)、硫銨上清(樣品3)和硫銨沉淀(樣品4)樣品，可見硫銨沉淀樣品中位于35.0 kD附近的條帶很粗，而硫銨上清液中不含有此條帶。電泳條帶能夠反映樣品蛋白分子量和濃度的變化，Leung和Motoyama研究發(fā)現(xiàn)TM分子量為35～38 kD，是一種酸性糖蛋白[11,12]，因此，我們認(rèn)為35.0 kD附近的條帶很可能是TM，煮沸和硫銨濃縮處理可以富集該蛋白質(zhì)濃度。采用甲殼類主要過敏原TM的特異性反應(yīng)單克隆抗體5G5E[22]的免疫印跡結(jié)果(圖1B)顯示，樣品1、2和4都對5G5E有特異性反應(yīng)，且樣品4的特異性反應(yīng)很強(qiáng)。上述結(jié)果表明電泳和免疫印跡的結(jié)果是相一致的，蝦抽提液經(jīng)煮沸、硫銨濃縮后富集了TM蛋白質(zhì)，其分子量在35 kD附近。

2.2體外模擬胃液消化對蝦中主要過敏原TM的影響 蝦TM的體外模擬胃液消化結(jié)果如圖2所示。由圖2A可知，與0 min的對照樣品(SGF中的酶失活)相比，TM條帶在15 min時降解明顯，60 min時TM條帶模糊可見，120 min時，TM條帶基本消失。隨著消化的進(jìn)行，在14.4～25.0 kD之間，由于TM的降解產(chǎn)生了一系列小分子條帶，60 min后基本只有14.4 kD 附近存在電泳條帶，表明TM在胃液中被胃蛋白酶初步分解，產(chǎn)生一些肽段。采用單克隆抗體5G5E對甲殼類主要過敏原TM有特異性反應(yīng)[22]，結(jié)果如圖2B，隨著消化時間的增加，TM條帶逐漸變淺，產(chǎn)生的降解產(chǎn)物(17～26 kD)與5G5E抗體有特異性反應(yīng)，表明TM的降解產(chǎn)物存在免疫活性。

2.3體外模擬胃液消化對TM免疫活性及過敏原性的影響 TM經(jīng)體外模擬胃液消化后，對不同時間的消化產(chǎn)物進(jìn)行間接ELISA檢測，結(jié)果如圖3。采用特異性反應(yīng)單克隆抗體5G5E[22]可表征樣本免

圖1 富集和鑒定蝦中TM的SDS-PAGE和Western blot結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE and Western blot results for enrichm-ent and identification of shrimp TMNote: A.Results of SDS-PAGE;B.Results of Western blot;M1.Protein marker (14.4-116 kD);M2.Protein marker (10-170 kD);1.Supernatant extraction;2.Boiling supernatant;3.Ammonium sulfate supernatant;4.Ammonium sulfate precipitation.

圖2 蝦TM在體外模擬胃液中的SDS-PAGE圖和Western blot圖Fig.2 SDS-PAGE and Western blot analysis of SGF digestion on shrimp TMNote: A.SDS-PAGE results for TM in vitro SGF;B.Western blot results for TM in vitro SGF;M1.Protein marker (14.4-116 kD);M2.Protein marker (10-170 kD);0-120.The digestion time of TM in vitro SGF (min);A-I:Electrophoresis strip for mass spectrometry.

疫活性，采用特異性識別TM的一個IgE結(jié)合位點的單克隆抗體CE7B2[8]可表征樣本過敏原性。對比不同時間段，發(fā)現(xiàn)TM免疫活性在0～10 min內(nèi)丟失速度最快，其后免疫活性丟失幅度減弱，60～120 min 時間段消減較慢，說明過敏原已大部分被降解，免疫活性的降低趨于穩(wěn)定。依據(jù)ELISA結(jié)果計算，TM免疫活性和過敏原性分別下降89.1%和80.8%。上述結(jié)果顯示，胃液消化免疫活性丟失比過敏原性更多，說明降解片段可能具有致敏性，模擬胃液對TM有一定的消化作用，經(jīng)胃液消化后TM的活性并不能完全消失。

酶解可使蛋白質(zhì)的肽鏈發(fā)生斷裂，產(chǎn)生小分子的多肽或氨基酸，破壞過敏原表位原有的空間結(jié)構(gòu)，從而降低其過敏性[23]。一般認(rèn)為，對于天然或變性食物蛋白質(zhì)來說，要保持其過敏原性，人IgE抗體所針對的蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)或線性氨基酸序列(即結(jié)構(gòu)和線性表位)必須經(jīng)受食物加工處理和體內(nèi)消化[10]。因此在胃液消化中，過敏原的一些表位會被破壞，但仍然存在一些表位抗消化。圖3顯示，0～30 min內(nèi)過敏原性丟失較快，電泳結(jié)果圖2A中30 min 時TM的條帶顏色較淺，說明TM在胃液消化中會被降解，部分表位在胃液消化過程中逐漸被破壞；由圖2B可知，TM在2 h時仍具有免疫活性，圖3顯示TM在2 h時過敏原性丟失80%，說明TM在胃液消化2 h時仍存在抗原表位。

2.4體外模擬胃液消化過程中TM抗原表位的變化 甲殼類的TM是一種糖蛋白，其分子量為34～38 kD，等電點4.5，廣泛存在于甲殼類水產(chǎn)品的肌肉中，并在肌肉收縮中起調(diào)節(jié)作用[11,12,24]。目前，已有多種蝦的抗原表位多肽被報道，本研究把國內(nèi)外已經(jīng)報道的抗原表位匯總在表1。

圖3 蝦TM在體外模擬胃液中ELISA圖Fig.3 ELISA results for SGF digestion on shrimp TM

表1 文獻(xiàn)報道的蝦主要過敏原(TM)的抗原表位匯總

Tab.1 Epitopes of shrimp allergen(TM) reported in literature

EpitopenumberEpitopeposition(AA)SequenceKey amino acidSpeciesReferencesE150-66MQQLENDLDQVQESLLK153-F,154-L(In corresponding epitope)Penaeus indicus[13]E2153-161FLAEEADRKE3119-148 AADESERMRKVLENRSLSDEERMDALENQLNot reportedPenaeus aztecus[25]E4153-179 FLAEEADRKYDEVARKLAMVEADLERAE5241-282FAERSVQKLQKEVDRLEDELVNEKEKYKSITDELDQTFSELSE643-57 VHNLQKRMQQLENDLNot reportedBrown shrimp[26]E785-105 VAALNRRIQLLEEDLERSEERE8133-148 RSLSDEERMDALENQLE9187-202 ESKIVELEEELRVVGNE10247-284QKLQKEVDRLEDELVNEKEKYKSITDELDQTFSELSGYE1143-55 VHNLQKRMQQLEN95-L 144-L 255-R 269-S(In corresponding epitope) Brown shrimp P.aztecus[14]E1287-101 ALNRRIQLLEEDLERE13137-141DEERME14144-151 LENQLKEAE15187-197 ESKIVELEEELE16249-259 LQKEVDRLEDEE17266-273 KYKSITDEE18273-281ELDQTFSELE1989-105 NRRIQLLEEDLERSEERR,Y,F,S,EPenaeus monodon[15]E20115-128 EASQAADESERMRKE21131-142 ENRSLSDEERMDE22145-164 ENQLKEARFLAEEADRKYDEE23177-190 ERAEERAETGESKIE24210-224 SEEKANQREEAYKEQE25243-259 ERSVQKLQKEVDRLEDEE26263-280EKEKYKSITDELDQTFSEE2712-25KLEKDNAMDRADTLE,A,K,L,RLitopenaeus Vannamei[16]E2828-41 QNKEANNRAEKSEEE2993-108 QLLEEDLERSEERLNTE30111-125 TKLAEASQAADESERE31129-140 VLENRSLSDEERE32150-163EARFLAEEADRKYDE33178-191 RAEERAETGESKIVE34203-216GNNLKSLEVSEEKANQ

為了研究富集液TM在體外模擬胃液消化過程中抗原表位的變化，本研究依據(jù)電泳結(jié)果，選擇不同消化時間的電泳條帶進(jìn)行了質(zhì)譜分析，分別標(biāo)記為A～I(xiàn)，所有樣品的質(zhì)譜分析結(jié)果如表2所示。經(jīng)胃液消化2 h后，消化片段中依然頑固存在的表位有3個，分別分布于TM的111～125、137～141和153～161肽段中。這些表位都能與患者血清結(jié)合，周瑾茹[16]通過競爭ELISA發(fā)現(xiàn)，E30與致敏患者血清的親和力較強(qiáng)；Shanti等[13]通過斑點印跡免疫分析，使用對蝦敏感的患者多克隆血清，發(fā)現(xiàn)E2可以抑制高達(dá)50%的過敏原特異性結(jié)合。除了頑固存在的完全被破壞的表位之外，我們還發(fā)現(xiàn)了4個疑似具有較強(qiáng)抗消化能力的抗原表位，分布于TM的50～66、144～151、145～164和150～163肽段中。結(jié)合免疫印跡結(jié)果(圖2B)，25～35 kD在2 h時有微弱的特異性反應(yīng)條帶，可能是G1和G2組中的表位一直存在。G3組中的表位在1 h后被破壞的有11個，分布于12～41、93～108、177～197和241～284肽段中，位于TM的C端和N端的表位較多。根據(jù)間接ELISA結(jié)果(圖3)，富集液TM在胃液消化30 min 時，過敏原性丟失率已經(jīng)達(dá)到71%，推測這些表位的破壞很可能是導(dǎo)致過敏原性丟失的主要原因。G4組中的表位在胃液消化中一些關(guān)鍵性氨基酸被破壞，Zheng等[15]研究發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵氨基酸即使只突變一個，都將影響蛋白質(zhì)底物作用的專一性，關(guān)鍵氨基酸的缺失可能會影響表位的致敏性。在對Pen ch18真菌過敏原的研究中，Cheng等[27]研究者采用丙氨酸依次替代各個氨基酸的方法確定了其中三個關(guān)鍵氨基酸，分別為Lys89、Lys90和Phe91。丙氨酸替代之后可以明顯降低Pen ch18與血清IgE的結(jié)合能力。被破壞關(guān)鍵氨基酸的表位是否仍具有過敏原性，需要今后進(jìn)一步合成相關(guān)表位進(jìn)行動物實驗驗證其構(gòu)效關(guān)系。

表2 富集液TM在胃液消化中抗原表位的變化

Tab.2 Changes of epitopes of enriched allergen TM in SGF

GroupsEpitopenumberMass spectrometry samples with different digestion times and molecular weights25-35 kDA(15 min)B(1 h)C(2 h)18.4-25 kDD(15 min)～18.4 kDE(15 min)F(1 h)14.4-18.4 kDG(15 min)H(1 h)I(2 h)G1E30+++?+?+?+E13++-++++++E2+++++++?+G2E1-+++--+--E14-++------E22?++??????E32?++??????G3E5---------E10---------E15+--------E17---------E18---------E23+--------E26---------E27---------E28---------E29---------E33+--------G4E3-?-??-?--E4?????????E6-???--?--E7????-?+--E8?+-++?+?+E9+????????E11-???--?--E12????--??-E16----+---+E19????-?+--E20?????????E21?+-++?+??E24----++---E25----+----E31-+-++-+--E34????++?+?

Note：+.Antigen epitope existed;-.Antigen epitope was destroyed;*.1-3 amino acid was destroyed.

表3 TM富集液在體外模擬胃液消化中抗消化的表位序列[13-16]

Tab.3 Resistant digestion epitope sequence of enriched TM in SGF[13-16]

GroupsEpitope numberSequencesKey amino acid(%)G1E30TKLAEASQAADESER80%E13DEERM60%E2FLAEEADRK89%G2E1MQQLENDLDQVQESLLK47%E14LENQLKEA75%E22ENQLKEARFLAEEADRKYDE75%E32EARFLAEEADRKYD79%

Note：Underline means key amino acid.

另外，TM富集液在胃液消化過程中產(chǎn)生的小分子也可能存在免疫原性，如E30、E13、E2表位不僅在25～35 kD中一直存在，在14.4～25 kD也存在。此外，質(zhì)譜結(jié)果顯示在2 h時，14.4～18.4 kD能檢測到E8，盡管E8在2 h時25～35 kD已經(jīng)被破壞，說明富集液TM產(chǎn)生的降解片段仍存在表位。

根據(jù)已報道的關(guān)鍵氨基酸，對頑固存在的及疑似抗消化的表位中的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行深入分析，由表3可知，G1組中E30和E2的關(guān)鍵氨基酸的比例最高，分別為80%和89%。G2組中3個表位有重疊區(qū)域150～151，并且150E和151A是表位中的關(guān)鍵氨基酸。關(guān)鍵氨基酸是表位中的活性氨基酸，與表位的致敏性有關(guān)[16,28]。研究發(fā)現(xiàn)除E1外，這些表位位于TM的中間區(qū)域，有空間結(jié)構(gòu)的保護(hù)，不易被酶解，因此能夠在胃液中抗消化[5]。因此，我們推測G1組中的3個表位的抗消化能力很可能是因為其中的關(guān)鍵氨基酸的作用所致。

3 討論

本研究通過對富集液TM的模擬胃液消化試驗，分析了消化過程中TM抗原表位的變化狀況。研究發(fā)現(xiàn)TM在消化過程會產(chǎn)生一些小分子降解產(chǎn)物，部分抗原表位會被破壞，但是TM在胃液中消化2 h時仍具有免疫活性，很可能是因為消化片段中存在有3個不被破壞的抗原表位和4個抗消化能力很強(qiáng)的抗原表位所致。本研究結(jié)果可為今后探討人體消化對TM過敏原性的影響機(jī)理及脫敏或低致敏性食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。