馬寅芙 劉 磊 王起來 蘆小單 孫牧男 林秀英 譚 巖 方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，長春 130021)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent spontaneous abortion，RSA)是常見的妊娠相關(guān)疾病，見于1%～3%的育齡婦女[1]?？沽字C合征(Antiphospholipid syndrome，APS)是一種發(fā)病涉及臨床多學(xué)科的自身免疫性疾病，是引起復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的常見病因。APS導(dǎo)致凝血、炎癥和流產(chǎn)的確切機制尚未完全明了，血小板激活和內(nèi)皮細胞活化是APS的重要病理過程，有效監(jiān)控血小板活化的發(fā)生及程度，探索內(nèi)皮細胞活化狀態(tài)對于防治APS具有重要的臨床意義[2-4]。本研究通過檢測APS流產(chǎn)患者血小板表面活化分子CD62P、CD40L的表達水平來評估APS流產(chǎn)患者的血小板活化程度，進一步分析其對內(nèi)皮細胞活化的作用，初步探索血小板活化介導(dǎo)的血小板-內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)參與APS誘發(fā)流產(chǎn)的機制及探討監(jiān)測APS流產(chǎn)患者血小板活化水平的臨床意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 以2006版國際協(xié)會Sappora分類標準[5]為入組依據(jù)。選取2016年7月至2018年10月在吉林省人民醫(yī)院就診的APS流產(chǎn)患者23例，年齡25～36歲，平均年齡(33.6±3.2)歲，孕6～10周，平均孕周(7.9±1.3)周；選擇同期來我院就診要求終止妊娠的正常健康早孕婦女31例，年齡20～38歲，平均年齡(32.5±4.1)歲，孕周6～12周，平均孕周(7.3±2.4)周,既往無流產(chǎn)、死胎、妊娠期高血壓疾病等病史。兩組采血前兩周內(nèi)均未服用抗血小板藥物。研究組與對照組婦女年齡、孕周等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

1.1.2主要試劑 血小板檢測用CD41-PE、CD62P-FITC、CD40L-FITC抗體(美國BD公司)；HUVECs細胞株由吉林省人民醫(yī)院中心實驗室保存和復(fù)蘇；IMDM培養(yǎng)基、胰蛋白酶為Gibco公司產(chǎn)品；小牛血清購于杭州四季青生物材料公司；純化鼠抗人CD40L單抗、脂多糖(LPS)(美國Sigma產(chǎn)品)；TRIZOL試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和熒光定量PCR相關(guān)試劑(Promega產(chǎn)品)；ELISA檢測IL-8試劑盒(Abcam產(chǎn)品)。

1.2方法

1.2.1血小板采集和血小板懸液制備 枸櫞酸鈉抗凝管采集血小板，患者空腹用14號針頭經(jīng)肘靜脈采血4 ml，防止任何震動，避免血小板活化；二步離心法獲取血小板懸液，分別于室溫下800 r/min離心20 min，取上層富含血小板血漿；再次室溫2 000 r/min 離心15 min，棄去上層血漿。PBS緩沖液洗滌血小板2次，IMDM培養(yǎng)基將血小板懸液調(diào)成為濃度4×109ml-1。

1.2.2CD62P、CD40L表達分析 流式細胞技術(shù)分別分析APS流產(chǎn)患者，正常早孕患者及健康體檢人群CD62P、CD40L表達水平。PBS液調(diào)整血小板濃度為2×109L-1，CD41-PE和CD62P-FITC抗體各5 μl 分析CD40L水平；CD41-PE和CD40L-FITC抗體各5 μl分析CD40L水平?？贵w與血小板混合后避光20 min，流式上機檢測。收集10 000個血小板，以血小板標志物CD41設(shè)門分析血小板表面>CD62P及CD40L的表達百分率。

表1 患者一般資料比較

Tab.1 Comparison of general data of patients

APS recurrentabortion(n=23)Normal earlypregnancy(n=31)PAge(Year)33.6±3.232.5±4.10.29Height(cm)161.6±5.8162.5±4.70.28BMI23.3±3.823.5±4.10.86Gestational week7.9±1.37.3±2.40.24

1.2.3血小板誘導(dǎo)HUVECs細胞 當(dāng)HUVECs細胞株達到80%以上融合狀態(tài)時，棄掉原培養(yǎng)液，加入血小板懸液。按照以下條件分組：①未刺激組，只含有HUVECs細胞；②LPS組：LPS(20 μg/L)與HUVECs細胞共同孵育；③APS血小板組：APS患者血小板懸液與HUVECs細胞共同孵育；④特異性CD40L單抗誘導(dǎo)組：CD40L單抗(20 μg/L)與APS組洗滌血小板懸液室溫下作用30 min后再與HUVECs細胞共同孵育；⑤對照血小板組：對照組血小板懸液與HUVECs細胞共同孵育；血小板與內(nèi)皮細胞在37℃、5%CO2條件下靜止孵育6 h，每組做3個復(fù)孔。

1.2.4IL-8表達 收集6孔板中共培養(yǎng)的細胞懸液，以3 000 r/min離心10 min，吸取上清，ELISA方法檢測IL-8的表達水平。

1.2.5ICAM-1基因表達 應(yīng)用SYBR Green嵌合熒光定量法檢測HUVECs細胞中ICAM-1基因mRNA表達水平。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性 45 s、55℃退火30 s、72℃延伸45 s，循環(huán)30次；72℃終延伸10 min。同一cDNA模板均在同一反應(yīng)條件下行三次重復(fù)實驗，結(jié)果應(yīng)用2-ΔΔCT進行統(tǒng)計分析。ICAM-1基因引物序列為F：′-CGAAGTGGTGAAGTTCATGG-3′，R：5′-GTACTC-GATCTCATCAGGGT-3′，GAPDH作為內(nèi)參對照基因，引物序列為F：5′-GTGAGZGGTCTCTCTCTTCCT-3′，R：5′-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3′。

2 結(jié)果

2.1血小板CD62P、CD40L的水平 結(jié)果顯示，早孕患者外周血血小板活化標志分子CD62P及CD40L表達水平均較正常健康人群水平升高(P<0.05)，APS流產(chǎn)組患者較正常健康早孕組顯著升高明顯(P<0.05)，APS流產(chǎn)組體內(nèi)血小板處于更高水平的活化狀態(tài)(圖1，表2)。

2.2內(nèi)皮細胞IL-8的表達 通過對IL-8分泌水平的比較分析，活化的血小板可以促進HUVECs細胞分泌IL-8，與正常早孕組相比，APS流產(chǎn)組IL-8水平顯著升高(3 659±727 vs 1 623±501)pg/ml，P<0.05；應(yīng)用特異性CD40L單抗可以導(dǎo)致HUVECs細胞分泌IL-8的水平降至(2 076±613)pg/ml，P<0.05(圖2，表3)。

2.3內(nèi)皮細胞ICAM-1的mRNA表達 通過對ICAM-1的mRNA相對水平的比較分析，與正常早孕組相比，APS組HUVECs細胞中ICAM-1基因表達相對水平顯著升高，特異性CD40L單抗可以顯著抑制HUVECs細胞中ICAM-1基因的相對表達水平(圖3，表4)。

圖1 流式細胞術(shù)檢測血小板表面CD62P和CD40L的表達水平Fig.1 Expression level of platelet of CD62P and CD40L analyzed by Flow cytometry method

表2 血小板CD62P和CD40L的表達水平

Tab.2 Expression level of CD62P and CD40L on platelet membrane of platelets

GroupsnCD62P(%)PCD40L(%)PAPS recurrent abortion2310.27±3.7613.26±5.21Normal early pregnancy318.31±2.430.0247.34±4.460.002Healthy crowd155.14±1.870.0014.05±1.690.009

Note：Normal early pregnancy vs Healthy crowd，P<0.05； APS recurrent abortion vs Normal early pregnancy，P<0.05.

圖2 HUVECs細胞分泌IL-8水平比較Fig.2 Comparison of IL-8 secretion levels in HUVECs cellsNote: 1.Control group;2.LPS group;3.APS recurrent abortion group;4.CD40L group;5.Normal early pregnancy group.*.APS recurrent abortion vs CD40L group,P<0.05；#.APS recurrent abortion vs normal early pregnancy group，P<0.05.

表3 HUVECs細胞分泌IL-8的水平

Tab.3 Level of IL-8 secreted by cultured HUVECs cells

GroupsIL-8(pg/ml)PUnstimulated group921±405LPS group4 236±812APS recurrent abortion group3 659±727CD40L group2 076±6130.045Normal early pregnancy group1 623±5010.016

Note：APS recurrent abortion vs Normal early pregnancy，P<0.05； APS recurrent abortion vs CD40L group，P<0.05.

圖3 HUVECs細胞ICAM-1 mRNA相對表達水平Fig.3 Comparison of ICAM-1 mRNA relative expression levels in HUVECs cellsNote: 1.Control group;2.LPS group;3.APS recurrent abortion group;4.CD40L group;5.Normal early pregnancy group.*.APS recurrent abortion vs CD40L group,P<0.05；#.APS recurrent abortion vs normal early pregnancy group，P<0.05.

表4 HUVECs細胞ICAM-1 mRNA相對水平

Tab.4 Relative expression levels of ICAM-1 mRNA in HUVECs cells

GroupsICAM-1 mRNAPUnstimulated group1.06±0.14LPS group1.81±0.25APS recurrent abortion group1.76±0.23CD40L group1.23±0.130.026Normal early pregnancy group1.30±0.140.042

Note：APS recurrent abortion vs Normal early pregnancy，P<0.05； APS Recurrent abortion vs CD40L group，P<0.05.

3 討論

抗磷脂綜合征(APS)是臨床習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生的主要原因之一[6，7]。致病因子抗磷脂抗體可以通過激活血小板、內(nèi)皮細胞、單核細胞及中性粒細胞等成分，引起機體發(fā)生促凝、組織損傷、炎癥等病理過程[8，9]。在正常生理狀態(tài)下，循環(huán)中的血小板處于靜息狀態(tài)，運行于血管內(nèi)；血管損傷、血流改變或化學(xué)物質(zhì)刺激等激活狀態(tài)下，血小板被活，表現(xiàn)為血小板膜表面、膜內(nèi)及血漿中特定的血小板糖蛋白成分發(fā)生改變。母體妊娠過程中，作為一種生理性保護，孕婦循環(huán)中的血小板逐步被活化，以防止分娩時過多失血。CD62P是儲存于血小板α顆粒中或內(nèi)皮細胞W-P小體中的一種糖蛋白，血小板或內(nèi)皮細胞一旦被激活則迅速表達于細胞膜上，參與血小板活化、黏附、聚集等生理過程[10，11]。我們的臨床研究證實，與正常妊娠相比，APS患者血小板活化標志物CD62P在血小板表面表達水平更高，說明在APS流產(chǎn)患者體內(nèi)，具有更高的血小板活化狀態(tài)。

CD40L是血小板活化后細胞膜表達的分子，是血小板參與疾病病理生理反應(yīng)的重要介質(zhì)分子，尤其是在介導(dǎo)血小板與內(nèi)皮細胞的相互作用中發(fā)揮主要作用。研究發(fā)現(xiàn)，CD40L可以介導(dǎo)內(nèi)皮細胞的損傷和凋亡，促進內(nèi)皮細胞表面表達黏附分子，分泌趨化因子、活性氧、組織因子，從而促進內(nèi)皮細胞參與炎癥反應(yīng)[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，APS流產(chǎn)患者血小板表面伴隨著CD62P表達增高的同時，CD40L水平也顯著升高，同時利用活化的血小板體外可以顯著促進培養(yǎng)的HUVECs細胞分泌炎癥因子IL-8水平和黏附分子ICAM-1基因的表達水平；而這種對內(nèi)皮細胞的誘導(dǎo)作用可以被特異性CD40L單抗抑制，說明血小板和內(nèi)皮細胞的相互作用是由CD40L介導(dǎo)的，這一過程參與了抗磷脂抗體導(dǎo)致血栓及炎癥的病理過程。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，通過競爭性結(jié)合血小板表面GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物，可以有效地阻斷血小板聚集，抑制抗磷脂抗體所致的血小板活化，減少APS發(fā)病中血小板聚集、血管和組織損傷，因而監(jiān)控血小板活化的發(fā)生及評估其活化程度是防治APS導(dǎo)致流產(chǎn)的重要手段[15-17]。本研究通過流式細胞術(shù)檢測分析APS流產(chǎn)患者血小板表面活化分子CD62P和CD40L的表達情況，可以有效地評估APS患者體內(nèi)血小板活化狀態(tài)和誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)能力，為臨床上監(jiān)測APS的病理過程提供有效的方法。