張秋葉 王極宇 張家奎 王會(huì)平 陶千山 翟志敏

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，合肥 230601)

急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute leukemia,AL)是成人常見(jiàn)的急性白血病亞型之一，主要分為B-ALL和T-ALL兩種。其中B-ALL最為常見(jiàn)，其發(fā)病率約占ALL的85%[1]。傳統(tǒng)的治療手段可使78%～93%的成人B-ALL患者達(dá)到完全緩解，長(zhǎng)期無(wú)病生存占40%[2]，然而50%以上的患者會(huì)復(fù)發(fā)，而且復(fù)發(fā)之后預(yù)后極差，總生存率僅為5%～8%[3]。近年來(lái)，細(xì)胞免疫治療取得重要進(jìn)展，嵌合抗原受體T細(xì)胞(Chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)治療復(fù)發(fā)/難治性B-ALL完全緩解率高達(dá)70%～80%[4]。在CAR-T細(xì)胞治療過(guò)程中，其最常見(jiàn)的不良反應(yīng)為細(xì)胞因子釋放綜合征(Cytokine release syndrome,CRS)。

CRS是由CARs與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的同源抗原結(jié)合后T細(xì)胞活化引發(fā)的[5]?；罨腡細(xì)胞和免疫旁細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子和趨化因子[6-10]，導(dǎo)致血清中細(xì)胞因子水平短時(shí)間內(nèi)急劇上升。輕度CRS一般給予支持治療即可有效控制病情,但重度CRS患者若不及時(shí)處理可能會(huì)出現(xiàn)低血壓、臟器功能衰竭等嚴(yán)重后果，甚至危及生命。目前明確報(bào)道與CRS嚴(yán)重程度有關(guān)的細(xì)胞因子有IL-6、C-反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)[11，12]，而其他與CRS嚴(yán)重程度有關(guān)的細(xì)胞因子報(bào)道并不多見(jiàn)。本研究通過(guò)檢測(cè)和比較CD19 CAR-T 細(xì)胞輸注前后血清IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α及CRP水平的變化,初步探討其是否可作為協(xié)助診斷CRS及疾病嚴(yán)重程度的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，以及在預(yù)測(cè)CD19 CAR-T 細(xì)胞療效、指導(dǎo)臨床選擇靶向細(xì)胞因子拮抗劑治療CRS中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 回顧性分析2015年8月至2018年2月到我科接受CD19 CAR-T細(xì)胞治療的復(fù)發(fā)/難治B-ALL患者23例，診斷標(biāo)準(zhǔn)及療效判斷標(biāo)準(zhǔn)均依據(jù)《成人急性B淋巴細(xì)胞白血病診療指南》2015年版。所有接受CD19 CAR-T細(xì)胞治療的患者對(duì)研究?jī)?nèi)容完全知情，并簽署知情同意書(shū)，該研究獲得醫(yī)院學(xué)術(shù)技術(shù)委員會(huì)和大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。同時(shí)在美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)中心注冊(cè)備案(NCT 02735291)，接受CAR-T治療患者的入組標(biāo)準(zhǔn)及治療方法，安全性和療效等已在2018第61屆美國(guó)血液學(xué)年會(huì)上發(fā)表(https://ash.confex.com/ash/2018/webprogram/Paper110539.html)，具體見(jiàn)本課題組已發(fā)表的研究摘要[13]。

1.1.2標(biāo)本采集 輸注CD19 CAR-T細(xì)胞前1 d、輸注CD19 CAR-T細(xì)胞結(jié)束后2 h、輸注后3周內(nèi)早晨空腹、發(fā)熱時(shí)(T>38.5℃)、退熱后第2天空腹時(shí)采集外周血3～5 ml，所有標(biāo)本均采集至乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管保存，后150 r/min離心5 min取血清,置于-80℃保存。

1.1.3CRS的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) CRS的診斷需滿足在輸注CAR-T細(xì)胞后3周內(nèi)出現(xiàn)以下4種癥狀或體征中的至少1種：發(fā)熱≥38℃；收縮壓<90 mmHg的低血壓;缺氧與動(dòng)脈血氧飽和度<90%;和/或器官毒性的證據(jù)[5],將發(fā)生CRS的23例患者根據(jù)毒性程度參見(jiàn)國(guó)家癌癥研究所不良事件常用術(shù)語(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)(CTCAE v4.0.3)分為輕度CRS組(1～2級(jí))和重度CRS組(3～5級(jí))。

1.2方法

1.2.1CD19 CAR-T細(xì)胞的制備和回輸主要分為3個(gè)步驟 ①分離PBMC。采集復(fù)發(fā)難治性B-ALL患者80～120 ml外周血分離PBMC。②將PBMC在抗CD3/CD28單克隆抗體(eBioscience，USA)和IL-2(SL Pharm，Beijing)刺激下短暫培養(yǎng)1～2 d，然后采用慢病毒法將CD19 CAR轉(zhuǎn)染至T細(xì)胞后繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)10～12 d。③ 對(duì)CAR-T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染率、活性度、病原體等系列檢測(cè)，質(zhì)量合格后轉(zhuǎn)入含有人血清白蛋白的100 ml生理鹽水的輸液袋中，每體重組患者單個(gè)療程回輸CAR-T細(xì)胞計(jì)量為每公斤1×109～5×109個(gè)。所有CAR-T細(xì)胞均由安徽北大未名細(xì)胞治療有限公司制備。

1.2.2微量樣本多重蛋白定量技術(shù)(Cytometric bead array，CBA)法檢測(cè)IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α 其中IL-6、IFN-γ檢測(cè)23例，IL-10、TNF-α由于標(biāo)本量少、標(biāo)本丟失、檢測(cè)不當(dāng)?shù)仍驅(qū)嶋H檢測(cè)患者共13例，免疫比濁法檢測(cè)CRP患者23例。CBA法和免疫比濁法具體步驟如下：將人細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品,按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256梯度稀釋。捕獲抗體充分振蕩混勻，取1 μl/樣本加入500 μl Buffer振蕩后離心(200 g，5 min)棄上清，加入Bead Biluent 50 μl/樣品，吹打混勻反應(yīng)15 min。標(biāo)記好樣品的管，取50 μl/管上述步驟后再取50 μl/管血清，吹打混勻避光1 h，檢測(cè)抗體充分振蕩混勻，檢測(cè)抗體 1 μl/樣本，再取Detection Diluent 49 μl/樣本避光吹打混勻，取50 μl混合好的檢測(cè)抗體加入樣品中(50 μl/樣本)，吹打混勻避光2 h，加入1 000 μl Wash Buffer 洗液(1 000 μl/樣本)，吹打混勻(200 g，5 min)離心棄上清，加入 300 μl Wash Buffer 上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將標(biāo)本數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，計(jì)算出細(xì)胞因子濃度。

免疫比濁法C反應(yīng)蛋白與特異抗體結(jié)合。形成不可溶的抗原抗體復(fù)合物。SYNCHRON系統(tǒng)按照比例自動(dòng)把適量體積的樣品和試劑分配到一個(gè)反應(yīng)杯中。所用的樣品對(duì)試劑比例為1∶26。系統(tǒng)將檢測(cè)340 nm的光吸收變化。此光吸收變化與樣品中C 反應(yīng)蛋白濃度成正比。系統(tǒng)依此并根據(jù)一條以單點(diǎn)調(diào)整、預(yù)先確定的校正曲線計(jì)算并給出C 反應(yīng)蛋白的濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，選擇t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，連續(xù)性變量以四分位數(shù)進(jìn)行表示，選擇Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1一般臨床資料 本研究共入組了23例復(fù)發(fā)/難治性B-ALL患者。其中男16例，女7例。中位年齡22歲。其中15例復(fù)發(fā)≤1次，8例復(fù)發(fā)≥2次。2例患者染色體Ph+。CD19 CAR-T細(xì)胞的回輸細(xì)胞數(shù)為1.03×106個(gè)/kg至18.00×107個(gè)/kg，回輸后所有患者均發(fā)生CRS，其中輕度CRS16例(1級(jí)14例、2級(jí)2例)，重度CRS 7例(3級(jí)5例、4級(jí)2例)?；剌敽?周后進(jìn)行療效評(píng)估，其中9例獲得完全緩解(Complete remission,CR)，9例獲得骨髓緩解(CR with imcomplete blood count recovery,CRi)，5例未緩解(None remission,NR)。具體見(jiàn)表1。

2.2CD19 CAR-T輸注前后血清中細(xì)胞因子與CRP水平 為了分析CD19 CAR-T細(xì)胞治療后患者細(xì)胞因子水平變化，我們檢測(cè)了所有患者在輸注CD19 CAR-T細(xì)胞前及輸注后血清細(xì)胞因子水平。所有患者輸注CD19 CAR-T細(xì)胞后均檢測(cè)至少3次，標(biāo)本采集時(shí)間點(diǎn)為輸注CD19 CAR-T細(xì)胞結(jié)束后2 h、輸注后3周內(nèi)早晨空腹、發(fā)熱時(shí)(T>38.5℃)、退熱后第2天空腹時(shí)。然后，我們分析比較了輸注后3周內(nèi)細(xì)胞因子最高水平與輸注前的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與輸注CD19 CAR-T細(xì)胞前相比，輸注后血清中IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α水平顯著性升高，(P=0.000，0.000，0.001，0.002)，我們同時(shí)分析了患者CRP的水平，發(fā)現(xiàn)輸注后CRP有升高趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.055),見(jiàn)表2、圖1、2。

表1 23例復(fù)發(fā)/難治B-ALL患者的基本臨床資料

Tab.1 Basic clinical data of 23 relapsed/refractory B-ALL patients

NumberSexAge(y)CAR-Tcells/kg(×107)Number ofrelapsesTumorburden(%)CytogeneticsGenesCRSgrading4 weeks responseafter CAR-T cellinfusion1M231.6860.840 0NN1CR2M78.920.900 07,XY,+8[1]/46,XY,[15]TEL-JAK2+1CR3M225.1220.040 046,XX,i(7q)[1];46,XX[1]N1CR4M330.12520.490 0NE2A/PBX1 +1CR5M125.210.530 0[46,XX,t(9;22)](q34;q11)[12]/46,idem,del(9)(q22)[6]/46,XX[2]BCR/ABL-P1901CR6M303.0310.875 0PhBCR-ABL(P190)+1CRi7M61.1610.160 045～47,XY,add(1)(p13)?2,del(7)(p15),t(8;14)(q24;q32),dic(9;12)(p24;q24),+12,20,inc[cp2]/46,XY[18]N1CR8F108.48 10.280 0t(16,21)(p11,q22)+N1CRi9M132.5710.450 0NN2CRi10F142.2020.030 0NN1NR11F98.5010.956 0NN2CRi12M21810.910 046,XY,t(8;14)(q24;q11)[3]/46,XY[17]MLL /MYC+1NR13F224.9320.820 0PhBCR/ABL P190(+)1CRi14F654.110.145 0NN1CRi15M344.2010.310 0NBCR-ABL-210 with T315i(E355G)1CR16M304.3840.180 0NN1NR17F353.8410.380 0NEPOR/IgH3CRi18M312.2000.720 048,XY,+8,+9[6]N3CR19M580.10310.830 0NN4NR20M193.8620.945 046,XYHOX-113CRi21M518.910.436 046,XY,[10]BCR/ABL(+),HOX(+)3CR22M403.8510.100 046,XY,12p+,+8q+,+13q+,-15,-22BCR/ABL P190(+),with T315I3CRi23F101.3500.800 054,X,+X,t(X;11)(q26;q23),+8,+8+18,+18,+21,+21[19]N4NR

Note：CR.Complete remission;CRi.Blood incomplete recovery of patients;NR.No remission.

表2 CD19 CAR-T細(xì)胞輸注前后細(xì)胞因子與CRP水平[M (P25 P75)]

Tab.2 Cytokine and CRP levels before and after CD19 CAR-T cell infusion[M (P25 P75)]

IndexnBefore CD19 CAR-Tcell infusionAfter CD19 CAR-Tcell infusionPIL-6(pg/ml)2312.00(2.00-28.50)58.00(34.50-112.00)0.000CRP(mg/ml)2315.50(5.35-31.38)33.32(14.33-54.99)0.055IFN-γ(pg/ml)232.65(2.13-3.12)6.70(4.35-10.07)0.000IL-10(pg/ml)131.00(1.00-1.80)8.88(4.01-39.92)0.001TNF-α(pg/ml)134.32(2.91-4.60)17.86(4.99-40.18)0.002

圖1 CD19 CAR-T細(xì)胞輸注前后血清中IL-6、CRP、IFN-γ水平(n=23)Fig.1 Levels of IL-6,CRP and IFN-γ in serum before and after CD19 CAR-T cell infusion(n=23)Note: A.The levels of IL-6 in serum;B.The levels of CRP in serum;C.The levels of IFN-γ in serum.**.P<0.01.

2.3CD19 CRA-T細(xì)胞輸注后輕度CRS、重度CRS細(xì)胞因子與CRP水平表達(dá)差異 所有患者在接受CD19 CAR-T細(xì)胞治療后均出現(xiàn)了不同程度的CRS。為了分析CD19 CAR-T細(xì)胞治療后輕度及重度CRS患者血清細(xì)胞因子表達(dá)譜，我們分析比較這些患者血清具體細(xì)胞因子表達(dá)水平差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：輸注CD19 CAR-T細(xì)胞后，重度CRS患者血清中各細(xì)胞因子水平IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α和CRP均顯著高于輕度CRS組(P=0.004，0.004，0.003，0.000，0.045)，見(jiàn)表3、圖3、4。

2.4重度CRS患者使用IL-6受體拮抗劑后IL-6水平變化 CD19 CAR-T細(xì)胞治療后患者若出現(xiàn)重度CRS往往病情危重，若不及時(shí)處理死亡率極高。本研究中4例IL-6水平顯著升高的重度CRS患者接受了IL-6受體拮抗劑治療后好轉(zhuǎn)。4例患者2周左右恢復(fù)正常，見(jiàn)圖5。

2.5CD19 CAR-T細(xì)胞不同療效間的細(xì)胞因子和CRP水平差異 CD19 CAR-T細(xì)胞治療后4周內(nèi)是否緩解分為CR/CRi組與NR組，比較CR/CRi組與NR組，兩組間IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α細(xì)胞因子與CRP水平，其中CR組/CRi組與NR組的IL-6、IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α細(xì)胞因子與CRP水平無(wú)顯著性差異，見(jiàn)表4。

圖2 CD19 CAR-T細(xì)胞輸注輸前后血清中IL-10、TNF-α水平(n=13)Fig.2 Levels of IL-10 and TNF-α in serum before and after CD19 CAR-T cells infusion(n=13)Note: A.The levels of IL-10 in serum;B.The levels of TNF-α in serum.**.P<0.01.

表3 CD19 CAR-T細(xì)胞輸注后輕度CRS、重度CRS細(xì)胞因子與CRP水平表達(dá)差異[M (P25 P75)]

Tab.3 Differential expression of mild CRS and severe CRS cytokines and CRP levels after CD19 CAR-T cell infusion[M (P25 P75)]

IndexMild CRS(n=16)Severe CRS(n=7)PIL-6(pg/ml)55.00(28.75-61.25)500.00(91.00-1074.00)0.004CRP(mg/ml)23.71(4.95-46.86)56.51(37.81-120.17)0.045IFN-γ(pg/ml)5.78(3.93-7.28)12.98(12.53-15.30)0.004IndexMild CRS(n=13)Severe CRS(n=5)PIL-10(pg/ml)4.69(3.13-7.47)55.65(39.92-84.97)0.003TNF-α(pg/ml)6.32(4.60-15.77)56.22(40.18-62.51)0.000

圖3 CD19 CAR-T細(xì)胞輸注后，輕度CRS、重度CRS血清中IL-6、CRP、IFN-γ水平(n=23)Fig.3 Levels of IL-6,CRP and IFN-γ in mild CRS and severe CRS after CD19 CAR-T cell infusion(n=23)Note: A.The levels of IL-6 in serum;B.The levels of CRP in serum;C.The levels of IFN-γ in serum.**.P<0.01,*.P<0.05.

圖4 CD19 CAR-T細(xì)胞輸注后，輕度CRS、重度CRS血清中IL-10、TNF-α水平(n=13)Fig.4 Levels of IL-10 and TNF-α in mild CRS and severe CRS after CD19 CAR-T cell infusion(n=13)Note: A.The levels of IL-6 in serum;B.The levels of TNF-α in serum.**.P<0.01.

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道CD19 CAR-T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤CRS發(fā)生率高達(dá)100%[14]，本研究中23例患者也均發(fā)生不同程度的CRS。CRS是一種與CD19 CAR-T細(xì)胞作用機(jī)制相關(guān)的獨(dú)特的靶向毒性作用[15]，其治療主要依賴(lài)于對(duì)發(fā)生CRS患者的準(zhǔn)確分級(jí)和在不影響CAR-T細(xì)胞療效的情況下控制CRS癥狀[16]。目前對(duì)CRS的分級(jí)主要根據(jù)臨床表現(xiàn)，缺乏實(shí)驗(yàn)室生物指標(biāo)。由于CRS患者血清中細(xì)胞因子會(huì)在短時(shí)間內(nèi)急劇上升的獨(dú)特的病理生理學(xué)特點(diǎn)，故升高的細(xì)胞因子與CRS和CRS嚴(yán)重程度的關(guān)系成為現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)[17]。Dvila等[18]認(rèn)為IFN-γ、IL-6、IL-5、IL-10、人FMS樣酪氨酸激酶3配體(Human FMS-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt-3L)、GM-CSF、分形趨化因子(Fracktalkine)這7個(gè)細(xì)胞因子水平變化與嚴(yán)重CRS診斷密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)與CD19 CAR-T細(xì)胞輸注前后血清中IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α水平顯著性升高，CRP有升高趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與病例數(shù)較少有關(guān)，有待于進(jìn)一步收集分析。通過(guò)對(duì)輕重度CRS患者血清中IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α細(xì)胞因子和CRP比較發(fā)現(xiàn)，重度CRS患者血清中IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α、CRP升高非常明顯，故我們認(rèn)為CRS且重度CRS可能與IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α、CRP有關(guān)。許多輕度CRS在很少干預(yù)就可緩解，然而發(fā)展到重度CRS最終可能導(dǎo)致短暫器官功能障礙，需要積極的干預(yù)和支持[15]，而針對(duì)重度CRS患者的治療主要是IL-6受體阻斷劑。本研究中4例IL-6顯著升高的重度CRS患者，使用IL-6受體拮抗劑治療后，患者2周左右完全恢復(fù)，故我們認(rèn)為IL-6受體阻斷劑治療IL-6升高的重度CRS患者有較好的療效。目前關(guān)于細(xì)胞因子水平與CAR-T療效間的報(bào)道并不多見(jiàn)，本研究中不同CD19 CAR-T細(xì)胞療效間IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α細(xì)胞因子與CRP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故我們認(rèn)為CD19 CAR-T細(xì)胞療效與細(xì)胞因子與CRP水平無(wú)關(guān)。此外，CD19 CAR-T細(xì)胞輸注后我們發(fā)現(xiàn)不同患者血清中IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α與CRP水平在個(gè)體間差異較大，有研究報(bào)道這可能因患者腫瘤負(fù)荷及CRS嚴(yán)重程度存在明顯差異所致，但與患者是否發(fā)熱無(wú)關(guān)[18]。

圖5 1～4例患者(A、B、C、D)使用IL-6受體拮抗劑后IL-6水平變化Fig.5 Changes in IL-6 levels after 1 to 4 patients (A,B,C,D)using IL-6 receptor antagonistsNote: Levels of IL-6 in A，B，C，D patients with severe CRS injection of tocilizumab.

表4 不同CD19 CAR-T療效間細(xì)胞因子水平與CRP差異[M (P25 P75)]

Tab.4 Differences in cytokine and CRP levels between different CD19 CAR-T efficacy[M (P25 P75)]

IndexCR/CRi(n=18)NR(n=5)PIL-6(pg/ml)57.00(41.00-118.00)70.00(31.00-82.00)0.945CRP(mg/ml)40.33(12.10-76.54)23.98(18.85-33.32)0.293IFN-γ(pg/ml)6.46(4.26-9.17)9.07(5.54-10.93)0.602IndexCR/CRi(n=8)NR(n=5)PIL-10(pg/ml)15.17(4.80-34.67)8.88(4.01-39.92)0.884TNF-α(pg/ml)19.98(12.46-33.21)7.66(4.99-56.22)0.957

綜上所述，CD19 CAR-T細(xì)胞治療復(fù)發(fā)難治性B-ALL具有良好的應(yīng)用前景。在治療過(guò)程中，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α細(xì)胞因子的水平，可作為判斷CRS嚴(yán)重程度的實(shí)驗(yàn)室參考指標(biāo)，并可指導(dǎo)臨床靶向選擇細(xì)胞因子拮抗劑，對(duì)防治重度CRS、確保CD19 CAR-T細(xì)胞治療的安全性有重要價(jià)值。