童晨曦 姜曉玲 劉 美 陳昌蓉 曾 艷 宋銀宏

(三峽大學醫(yī)學院病原與免疫學系，三峽大學感染與炎癥損傷研究所,宜昌 443002)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一種多發(fā)生于兒童和青少年的骨惡性腫瘤，其惡性程度極高。目前，骨肉瘤的主要治療方案是手術(shù)和放化療。多種治療手段的發(fā)展使患者的5年生存率提高到60%，但發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者5年生存率小于20%[1]。對抗癌療法產(chǎn)生抗性是造成腫瘤轉(zhuǎn)移和患者死亡的主要原因，其發(fā)生機制與免疫系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng)也息息相關(guān)[2]。因此，研究具有選擇性細胞毒性的藥物對治療骨肉瘤具有實際意義。白藜蘆醇(Resveratrol,RES)是一種來自葡萄、桑葚、花生和其他植物的天然植物多酚化合物，作用十分廣泛，其對抗炎、抗氧化等都有一定功效[3]。而白藜蘆醇的抗癌特性更是引起了很大關(guān)注。有文獻報道白藜蘆醇對多種腫瘤細胞有抑制作用，如卵巢癌、皮膚癌[4-6]。對于骨肉瘤，也有研究組開展了白藜蘆醇對骨肉瘤抑制作用的實驗研究。但是對其是否能增強骨肉瘤細胞的免疫原性和體內(nèi)的免疫應(yīng)答并不是十分清楚。本研究進一步探討了白藜蘆醇對骨肉瘤K7M2細胞系的抗增殖作用，并對白藜蘆醇增強骨肉瘤細胞的免疫原性進行了探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株和實驗動物 小鼠骨肉瘤細胞株K7M2購自上海中科院細胞庫。BALB/c 小鼠(雌性，6～8 周齡，體重約16～18 g)購于三峽大學實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號：42010200001767。

1.1.2主要試劑和儀器 白藜蘆醇(成都克洛瑪生物科技有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco)；細胞凋亡試劑盒(BD公司)；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、細胞周期試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；TRIzol Reagent(Invitrogen);PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PowerUpTM SYBR Green Master Mix(Thermo Scientific)；蛋白提取試劑盒(索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific);β-actin兔抗鼠單克隆抗體、CyclinE1兔抗鼠單克隆抗體和XIAP兔抗鼠單克隆抗體(Ruiying Biological)；Mcl-1兔抗鼠單克隆抗體、Bcl-2兔抗鼠單克隆抗體，Bax兔抗鼠單克隆抗體和Caspase-3兔抗鼠單克隆抗體(Cell signaling technology)；Kras兔抗鼠單克隆抗體(Abcam)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(谷歌生物科技有限公司)；H-2Kd-FITC (MHCⅠ),I-A/I-E-PE (MHCⅡ)(BD公司)；CD45-APC熒光單克隆抗體(Biolegend)；BD FACSVerse流式細胞儀(BD公司)；Multiskan Spectrum全波長酶標儀(Thermo Scientific)；StepOnePlus 實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)；GelX凝膠成像系統(tǒng)(上海歐翔科學儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) K7M2細胞用含 10% 胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。隔天換液，每隔2 d傳代一次。

1.2.2MTT檢測細胞增殖 將細胞接種在96孔平底板中(6 000 個/孔)。分不同濃度組(80、40、20、10、5 μmol/L)的RES處理細胞24 h、48 h和72 h，每組設(shè)置6個復(fù)孔，同時設(shè)置陰性對照組和空白對照組，陰性對照組用與藥物相同體積的DMSO處理。相應(yīng)時間點用含有10%MTT(5 mg/ml)溶液的150 μl新鮮培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基。在37℃溫育4 h后，除去MTT溶液，并用150 μl DMSO溶解細胞內(nèi)甲瓚晶體。酶標儀在570 nm處的測定每孔吸光度(A)值。實驗組和陰性對照組均減去空白對照組(A)值后，計算細胞抑制率，細胞抑制率=(陰性對照組-實驗組)/陰性對照組×100%。

1.2.3細胞凋亡實驗 K7M2細胞用20 μmol/L和40 μmol/L的RES孵育48 h。設(shè)置單染組和對照組，對照組用與藥物相同體積的DMSO處理。用不含EDTA的消化酶消化后收集細胞并調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml，PBS洗滌2次，用100 μl 的1×Binding buffer重懸，然后加入2.5 μl PE和5 μl 7-AAD染液在25℃避光環(huán)境下孵育15 min。然后上流式細胞儀檢測不同處理組細胞凋亡變化。

1.2.4細胞周期實驗 K7M2細胞用20 μmol/L和40 μmol/L的RES培養(yǎng)48 h，對照組加入與藥物相同體積的DMSO。收集細胞PBS洗滌兩次，用70%乙醇于4℃固定一夜，用PI和RNase A溶液染色，流式細胞術(shù)分析不同處理組細胞周期比例。

1.2.5實時定量多聚酶鏈聚合反應(yīng)(RT-qPCR)檢測細胞凋亡和細胞周期相關(guān)基因的表達量 K7M2細胞用20 μmol/L和40 μmol/L的RES培養(yǎng)48 h，對照組加入與藥物相同體積的DMSO。用TRIzol從K7M2細胞中提取RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green Master Mix在StepOnePlus Real-Time PCR System儀器上進行RT-qPCR反應(yīng)。β-actin作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算Xiap、Kras、Bcl-2、Mcl-1、CyclinE1、Bax和Caspase-3相對表達量。RT-qPCR反應(yīng)條件：95℃ 45 s,56℃ 30 s,72℃ 3 min,40個循環(huán)。所有引物序列及相關(guān)信息見表1。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測細胞凋亡和細胞周期相關(guān)蛋白的表達量 K7M2細胞用20 μmol/L 和40 μmol/L的RES培養(yǎng)48 h，對照組加入與藥物相同體積的DMSO。用RIPA裂解液提取K7M2細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜上，置于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入相應(yīng)目的蛋白的一抗于4℃孵育過夜，TBST洗膜3次后二抗室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光試劑顯色。IPP6.0對顯影出來的條帶進行分析。

1.2.7流式細胞術(shù)檢測分子

1.2.7.1體外K7M2細胞系MHC分子的檢測 K7M2細胞用20 μmol/L和40 μmol/L的RES處理48 h。收集細胞并設(shè)置對照組和單標記組，對照組加入與藥物相同體積的DMSO。用熒光單克隆抗體H-2Kd-FITC (MHCⅠ)、I-A/I-E-PE(MHCⅡ)以1∶100 稀釋比例加入不同處理組，冰上避光孵育60 min，流式細胞儀檢測各組MHCⅠ類和MHCⅡ類分子表達變化。

1.2.7.2荷骨肉瘤小鼠模型腫瘤細胞MHC分子的檢測 6～8周齡，體重16～18 g雌性BALB/c小鼠按體重隨機分為3組。高劑量治療組為100 mg/kg，低劑量治療組為50 mg/kg，對照組注射含藥物相同體積DMSO的PBS溶液。首先構(gòu)建荷骨肉瘤小鼠模型，體外培養(yǎng)的K7M2細胞制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×105個/ml，取200 μl細胞懸液注射于小鼠右側(cè)腋窩皮下。用游標卡尺測量體積，當瘤體體積≥0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm，判斷荷瘤成功。每日稱量體重后，將藥物用PBS溶液按分組劑量配制好后，每只取200 μl于瘤周皮下注射，注射用藥16 d，頸椎脫臼處死小鼠，無菌取腫瘤組織剪碎、研磨擠壓成單細胞懸液后,離心、棄掉上清。300 g 離心 5 min 后棄上清收集細胞,不同處理組分別加入1∶100 稀釋的單克隆抗體組合(H-2Kd-FITC、I-A/I-E-PE和CD45-APC),4℃避光反應(yīng)60 min，各管加入 3 ml PBS重懸,300 g離心5 min后棄上清,重復(fù)2次;上流式細胞儀分析不同組腫瘤細胞(CD45-)MHC分子表達變化。

表1 PCR引物

Tab.1 PCR primers

GenePrimer sequence(5′-3′)β-actin F:GTGGATCAGCAAGCAGGAGTR:GTGGATCAGCAAGCAGGAGTXiapF:TTGGAACATGGACATCCTCAR:TACCACTTCGCATGCTGTTCKrasF:AGAGCGCCTTGACGATACAGR:CCCTCCCCAGTTCTCATGTAMcl-1F:CAAAGATGGCGTAACAACTGGR:CGTTTCGTCCTTACAAGAACABcl-2F:GATGACTGAGTACCTGAACCGR:CAGAGACAGCCAGGAGAAATCCyclinE1F:GCGAGGATGAGAGCAGTTCR:AAGTCCTGTGCCAAGTAGAACBaxF:CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAGR:CCAGCCCATGATGGTTCTGACaspase-3F:ACCATGGAGAACACTGAAR:TTAGTGATAAAAATAGAG

2 結(jié)果

2.1RES對骨肉瘤K7M2細胞增殖的影響 MTT法檢測細胞增殖，結(jié)果如圖1所示，RES處理細胞24 h后，40 μmol/L及80 μmol/L兩個處理組的細胞增殖抑制率分別為38.24%及38.87%。處理細胞48 h后，20、40、80 μmol/L三個處理組的細胞抑制率均大于30%；處理細胞72 h后，5、10、20、40和80 μmol/L的RES均可顯著抑制K7M2細胞增殖。相同濃度RES作用K7M2細胞，抑制率隨著藥物作用時間的延長而提高，這說明RES抑制骨肉瘤K7M2細胞增殖具有時間依賴性。

2.2RES對骨肉瘤K7M2細胞凋亡的影響 用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，結(jié)果如圖2所示，與DMSO組相比較，RES(20 μmol/L和40 μmol/L)組的細胞凋亡率顯著升高(P<0.01，P<0.001)，存活細胞顯著減少(P<0.05，P<0.001)，表明RES能顯著誘導(dǎo)骨肉瘤K7M2細胞凋亡。

2.3RES對骨肉瘤K7M2細胞周期的影響 流式細胞術(shù)檢測細胞周期，發(fā)現(xiàn)與DMSO組相比較，RES(20 μmol/L和40 μmol/L)組S期的K7M2細胞均顯著增多(P<0.05，圖3)。表明RES能誘導(dǎo)骨肉瘤K7M2細胞周期阻滯在S期。

圖1 RES顯著抑制K7M2細胞增殖Fig.1 RES significantly inhibited K7M2 cell proliferationNote: Cell inhibition rate was determined by MTT assay.***.P<0.001.

2.4RES對細胞凋亡和細胞周期相關(guān)基因和蛋白表達量的影響 用后RT-qPCR檢測基因表達，發(fā)現(xiàn)與DMSO組相比較，20 μmol/L RES處理組Xiap、Kras、Bcl-2和Mcl-1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.001，圖4A)，而Cy-clinE1、Bax和Caspase-3 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05，圖4B)；40 μmol/L RES處理組Xiap、Kras、Bcl-2和Mcl-1 mRNA表達水平同樣顯著降低(P<0.001、P<0.05、P<0.05、P<0.001，圖4A)，而CyclinE1、Bax和Caspase-3 mRNA表達水平顯著升高(P<0.01、P<0.05、P<0.05，圖4B)。用Western blot檢測蛋白，結(jié)果如圖4C所示，與DMSO組相比較，RES(20 μmol/L和40 μmol/L)組Xiap、Kras、Bcl-2和Mcl-1的蛋白表達水平顯著降低，而CyclinE1、Bax和Caspase-3 的蛋白水平表達顯著升高，同mRNA水平改變趨勢相一致。

圖2 RES顯著誘導(dǎo)K7M2細胞凋亡

Fig.2 RES significantly induced apoptosis in K7M2 cells

Note: Cell apoptosis and viability were determined by flow cytometry.Compared with group DMSO,n=3,*.P<0.05.**.P<0.01.***.P<0.001.

圖3 RES顯著誘導(dǎo)K7M2細胞周期阻滯于S期

Fig.3 RES significantly induced K7M2 cell cycle arrested at S phase

Note: Cell cycle was determined by flow cytometry.Compared with group DMSO,n=3,*.P<0.05.

2.5RES對體內(nèi)外骨肉瘤MHC分子表達的影響 用流式細胞術(shù)檢測MHC分子的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與DMSO組相比較，RES(20 μmol/L和40 μmol/L)在體外處理K7M2細胞后，細胞的MHCⅠ類分子(圖5A)及MHCⅡ類分子(圖5B)的表達量均顯著增加(P<0.05、P<0.01；P<0.05、P<0.01)。在體內(nèi)實驗中，與對照組小鼠相比，RES(50 mg/kg和100 mg/kg)處理的荷骨肉瘤小鼠的腫瘤細胞MHCⅠ類分子表達量顯著增高(P<0.01、P<0.001，圖5C)，同時，MHCⅡ類分子表達量也顯著增高(P<0.01、P<0.001，圖5D)。表明RES能顯著增強體內(nèi)外骨肉瘤K7M2細胞的免疫原性。

圖4 RES對K7M2細胞凋亡和細胞周期相關(guān)的基因和蛋白表達量的影響Fig.4 Effect of RES on expression of mRNA and protein in K7M2 cellsNote: A，B.The expression of mRNA was determined by RT-qPCR.Compared with group DMSO.n=3，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.C.The expression of protein was determined by Western blot.

圖5 RES顯著增強體內(nèi)外K7M2細胞MHC分子表達Fig.5 RES significantly enhanced MHC molecule expression of K7M2 cellsNote: The expression of MHC was determined by flow cytometry.Compared with group DMSO.n=3，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展受一系列復(fù)雜機制的影響，其中包括原癌基因和腫瘤抑制基因的突變以及凋亡過程的改變，凋亡的累積同樣會影響細胞周期的穩(wěn)態(tài)。同時也與癌細胞的識別或腫瘤生長同抗腫瘤免疫應(yīng)答之間的平衡有關(guān)[7]。那么對于宿主而言，抗腫瘤免疫就起著十分重要的作用。此前大量研究表明，化療藥物對腫瘤細胞的作用機制主要是通過誘導(dǎo)細胞同期停滯和細胞凋亡[8,9]，而關(guān)于白藜蘆醇影響骨肉瘤免疫應(yīng)答的研究較少。本研究采用骨肉瘤K7M2細胞，首先體外檢測RES對K7M2細胞毒性作用，對細胞凋亡和細胞周期的影響。發(fā)現(xiàn)用20 μmol/L和40 μmol/L RES處理K7M2細胞48 h后能夠有效誘導(dǎo)細胞凋亡，并使細胞周期阻滯在S期。與此同時，與細胞凋亡和細胞周期相關(guān)基因和蛋白的表達水平也發(fā)生了改變。Bcl-2、Bax和Mcl-1同屬于B淋巴細胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族，Bcl-2和Mcl-1發(fā)揮著抗凋亡作用，而Bax屬于促凋亡基因，共同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[10]。X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是凋亡蛋白抑制劑(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中的一員，可直接抑制Caspase-3，并傳遞不依賴Caspase的信號。這樣，作為下游終末剪切酶效應(yīng)的Caspase-3就不能發(fā)揮其促進凋亡發(fā)生的作用[11,12]。K-ras編碼一種調(diào)節(jié)增殖、分化和細胞存活的膜相關(guān)GTP酶信號蛋白，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，會導(dǎo)致預(yù)后不良[13]。CyclinE1作為細胞周期從G1期向S進展的重要調(diào)節(jié)因子，在大多數(shù)人類癌癥中表達，并與腫瘤發(fā)生相關(guān)[14]。本文發(fā)現(xiàn)20 μmol/L和40 μmol/L RES處理K7M2細胞48 h后，Mcl-1、Xiap、K-ras和Bcl-2 mRNA和蛋白水平明顯降低，而Bax和Caspase-3明顯增高，這些基因和蛋白的表達變化都能促使腫瘤細胞凋亡的發(fā)生。有趣的是，CyclinE1 mRNA和蛋白表達水平也顯著增加，這種變化可能也與在多細胞生物中，周期分裂是與外部環(huán)境和內(nèi)部細胞狀態(tài)相結(jié)合，細胞分裂過程中變化的類型也不盡相同有關(guān)[15]。還可能與其他周期蛋白(如細胞周期中CyclinD1和CyclinE1)表達的高低、相互調(diào)控以及腫瘤類型相關(guān)聯(lián)[16]。還有可能是某些惡性腫瘤本身的發(fā)展過程中CyclinE1的擴增很少，藥物治療后會發(fā)生其他變化。當然，徹底闡明其機制需要開展更多的相關(guān)研究工作。但事實上，在本研究中CyclinE1的升高導(dǎo)致了G0/G1期細胞減少，細胞周期阻滯在S期，但G2/M期并無顯著改變。

許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在60%～90%的不同組織學起源的人類癌癥如頭頸部、皮膚、乳腺和肺中MHC Ⅰ 類分子表達下調(diào)或完全喪失[17,18]。具有下調(diào)MHC表達的癌癥有更大的轉(zhuǎn)移潛能，對患者預(yù)后不良[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在20 μmol/L和40 μmol/L RES處理K7M2細胞48 h后，體外培養(yǎng)的K7M2細胞系中MHC Ⅰ 類、MHC Ⅱ 類分子的表達量顯著增加。同樣的結(jié)果在體內(nèi)動物研究也得到了驗證。通過構(gòu)建荷骨肉瘤小鼠模型，50 mg/kg和100 mg/kg 的RES在腫瘤局部注射16 d后，發(fā)現(xiàn)荷骨肉瘤小鼠腫瘤細胞中MHC Ⅰ 和MHC Ⅱ 類分子的表達都顯著增高，有顯著的統(tǒng)計學差異。腫瘤逃避免疫識別的一個重要機制即是降低遞呈腫瘤抗原給細胞毒性T細胞的MHC Ⅰ 類分子的表達[21,22]，MHC Ⅰ 類表達增加，表明RES可減弱MHC Ⅰ 類分子低表達而產(chǎn)生的免疫逃逸。MHC Ⅱ類分子在腫瘤細胞中一般并不表達，而在RES處理后，MHC Ⅱ 類分子表達增多則被認為是抗原提呈能力增強的表現(xiàn)，可能會增強免疫反應(yīng)[23]。我們推測，同MHC分子的改變一樣，體內(nèi)會有眾多免疫細胞的改變來對抗骨肉瘤。綜上所述，RES具有抑制骨肉瘤細胞增殖的作用，另外其也具有提高抗腫瘤免疫的潛力。本研究在動物模型治療過程中也初步觀察到50 mg/kg和100 mg/kg的RES對小鼠骨肉瘤體積有抑制效應(yīng)，未來將在進一步的研究中明確其治療效果。此外，在進一步的研究中，還將檢測腫瘤組織中募集的免疫細胞變化，探討RES對骨肉瘤小鼠腫瘤的抑制作用及對抗腫瘤免疫是否有增強作用，并討論其可能的機制。