杜付玉 廖成水 郁 川 張春杰 程相朝 楊亞東

(河南科技大學動物科技學院,洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，洛陽 471023)

鼠傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar typhimurium)一直是世界范圍內(nèi)引起人類食物中毒的主要病原菌[1]。目前主要通過抗生素進行預(yù)防和治療，但隨著抗生素的濫用，增強了沙門菌的耐藥性，這不僅降低了治療效果，而且增加了預(yù)防和控制的負擔[2]。目前通過基因工程方法構(gòu)建減毒沙門菌作為口服疫苗是研究的熱點[3]。

不同沙門菌致病島(SPI1和SPI2)編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲsecretion system，T3SS)分泌到細胞中的一系列效應(yīng)物，幫助沙門菌逃避宿主的殺傷作用并在宿主細胞內(nèi)存活和復制[4]。沙門菌分泌性蛋白K3(Salmonella secreted effector K3，SseK3)是新發(fā)現(xiàn)的一種沙門菌T3SS的效應(yīng)蛋白。研究推測sseK3可能參與了沙門菌的毒力，但具體的作用機制尚不明確[5]。目前對于sseK3的研究相對滯后，且有關(guān)于鼠傷寒沙門菌sseK3基因功能等相關(guān)研究在國內(nèi)尚未見報道。因此，本研究運用重組自殺性質(zhì)粒介導的等位基因交換技術(shù)，構(gòu)建鼠傷寒沙門菌sseK3基因缺失株，并對其生物學特性進行檢測，為更進一步探究sseK3基因的功能及鼠傷寒沙門菌減毒活疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 鼠傷寒沙門菌SL1344標準毒株、大腸桿菌χ7213和自殺性質(zhì)粒pRE112、大腸桿菌DH5α、pBR322質(zhì)粒均由本室保存；沙門菌屬診斷血清(11種)和各種單因子血清均購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；兔抗鼠IgG-HRP酶標二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；二氨基庚二酸(D L-α,ε-Diaminopimelic acid,DAP)購自美國Sigma-Aldrich公司；TMB顯色液購自碧云天生物技術(shù)研究所；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；細菌微量生化反應(yīng)管購自杭州濱和微生物試劑有限公司；實驗動物均為6周齡BALB/c小鼠(雌雄各半)，合格證號SCXK(豫)2017-000l，購自鄭州大學實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計與合成 根據(jù)相關(guān)文獻[6]及GenBank中的鼠傷寒沙門菌SL1344(No.U25631.1)設(shè)計引物(見表1)，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2重組自殺性質(zhì)粒pRE112ΔsseK3的構(gòu)建及鑒定 以鼠傷寒沙門菌SL1344基因組為模板，用引物PsA/PsB和引物PsC/PsD分別擴增上下游同源臂。通過融合PCR，用引物PsA和PsD擴增出不含sseK3基因的同源重組片段，克隆至質(zhì)粒pMD18-T，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-AD，雙酶切并連接至自殺性質(zhì)粒pRE112，進而轉(zhuǎn)化至χ7213中，得到重組質(zhì)粒pRE112-AD，將其命名為pRE112ΔsseK3。

1.2.3鼠傷寒沙門菌sseK3缺失株的構(gòu)建及篩選 通過自殺性質(zhì)粒介導細菌基因的接合轉(zhuǎn)移，兩步篩選法篩選出基因缺失株。其中χ7213(pREΔsseK3)作為供體菌，SL1344為受體菌。將χ7213(pREΔsseK3)和SL1344混合，在37℃培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)好的菌液均勻涂布于平板，挑選Cm抗性的菌落， 設(shè)供體菌和受體菌對照， 使用引物PsE/PsF進行擴增鑒定陽性接合子。將陽性接合子轉(zhuǎn)接至無NaCl的LB培養(yǎng)基(NB)，加入10%的蔗糖，37℃過夜培養(yǎng)后，稀釋至一定稀釋度，將其涂布至麥康凱平板(含有1%麥芽糖)，初步篩選出sseK3缺失株。使用引物PsG/PsF、PsE/PsF對sseK3缺失株進行PCR擴增并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 PCR擴增所需引物

Tab.1 Primer for PCR amplification

Gene amplifiedPrimerPrimer sequence(5′-3′)Restriction siteFragment length(bp)Upstream of sseK3PsATCTAGACCGCGAGTGACATCAATATTAXbaⅠ1 019PsBCATACGTTTGCAAATAATTTTCAACCCTTACGCTADownstream of sseK3PsCTAGCGTAAGGGTTGAAAATTATTTGCAAACGTATG1 037PsDGGTACCTACCTGGAACAATGCAGGTTKpnⅠsseK3/ΔsseK3PsEGCCCCCCCTAACCAAGTAAAAACTAT1 463(wt)PsFCTAAATATTCAGGCGGGTTTATTACCC455(ΔsseK3)sseK3/ΔsseK3PsGAGCGCGTTTCCCTCACAGCAATTAAT2 410(wt)PsFCTAAATATTCAGGCGGGTTTATTACCC1 402(ΔsseK3)sseK3PFAAGCTTATGTTTTCTCGAGTCAGAHindⅢ1 008PRGGATCCTTATCTCCAGGAGCTGATABamHⅠinvAPs1CAGGATACCTATAGTGCTGC580Ps2CGCACCGTCAAAGGAACCGT

1.2.4鼠傷寒沙門菌sseK3互補菌株的構(gòu)建與鑒定 以鼠傷寒沙門菌SL1344基因組為模板，用引物PF/PR擴增出sseK3基因，然后將擴增出的sseK3基因片段回收并連接至pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-sseK3，經(jīng)PCR及測序鑒定正確后，用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切pMD18-T-sseK3，回收片段并將其連接至質(zhì)粒pBR322，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBR322-sseK3。然后電轉(zhuǎn)至構(gòu)建的SL1344ΔsseK3缺失菌株中構(gòu)建回復菌株SL1344CΔsseK3，挑取單個菌落進行PCR及雙酶切鑒定并進行序列測定。

1.2.5鼠傷寒沙門菌sseK3缺失株生物學特性檢測

1.2.5.1sseK3缺失株的表型鑒定及生化特性分析 缺失菌株SL1344ΔsseK3的表型鑒定：利用玻片凝集試驗鑒定sseK3缺失株的血清型，并將sseK3回復菌株、sseK3缺失株與親本株SL1344分別接種于有無1%麥芽糖的麥康凱瓊脂平板，然后轉(zhuǎn)接至葡萄糖、乳糖、麥芽糖等細菌微量生化反應(yīng)管中檢測。

1.2.5.2sseK3缺失株遺傳穩(wěn)定性的測定 在LB液體培養(yǎng)基中，將sseK3缺失株連續(xù)傳60代，用PsG/PsF引物進行PCR分別擴增鑒定第10、20、30、40、50、60代，檢測sseK3缺失株是否能夠穩(wěn)定遺傳。

1.2.5.3sseK3缺失株生長曲線的繪制 將sseK3缺失株、sseK3回復菌株與親本株SL1344分別接種于LB培養(yǎng)基，并在37℃下培養(yǎng)14 h，分別取菌液稀釋至一定濃度并涂至LB固體平板上，通過板上的菌數(shù)進而計算初始菌液中的菌數(shù)。然后，將細菌轉(zhuǎn)接至相同的液體培養(yǎng)基致終濃度為106CFU/ml，每間隔1 h進行涂板計算菌液中的菌數(shù)，通過記錄每小時的菌數(shù)從而繪制生長曲線。

1.2.5.4sseK3缺失株半數(shù)致死量(LD50)的測定 將192只6周齡BALB/c小鼠，隨機分為16組，每組12只。將sseK3缺失株、回復菌株和親本株SL1344在LB液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過夜，并進行平板計數(shù)以計算攻毒劑量。選取合適的稀釋度，每個稀釋度口服感染12只6周齡BALB/c小鼠，每只200 μl，觀察直至無小鼠死亡，同時設(shè)生理鹽水空白對照組。用SS和1%麥芽糖的麥康凱固體平板無菌接種死亡小鼠的肝臟，并對invA基因進行PCR擴增，確定并記錄小鼠的真實死亡情況，記錄的結(jié)果根據(jù)Bliss法計算出小鼠的半數(shù)致死量(LD50)。

1.2.5.5sseK3缺失株免疫小鼠IgG抗體的測定 將56只6周齡BALB/c小鼠隨機分為實驗組與對照組，實驗組分別于第1天、8天以sseK3缺失株(1×106CFU)灌服進行一免、二免，對照組灌服等量生理鹽水。于二免后1、7、11、14、21、28、35 d從實驗組與對照組中每次分別取4只小鼠采血分離血清，參照參考文獻[6]，以鼠傷寒沙門菌SL1344裂解物作為檢測抗原，應(yīng)用間接ELISA方法檢測各個血清中的IgG抗體水平。

1.2.5.6sseK3缺失株免疫小鼠保護率的測定 將48只6周齡BALB/c小鼠平均隨機分成4組，分別設(shè)sseK3缺失株實驗組1和組2，生理鹽水陰性對照組1和組2。制備免疫和攻毒菌液，分別于第1天和第8天對實驗組以sseK3缺失株(1.0×106CFU)對每只小鼠灌服免疫，對照組灌服等量的生理鹽水。在第二次免疫后第7天，利用SL1344親本株(1.0×107CFU)分別對實驗組1、陰性對照組1小鼠進行灌胃，但是實驗組2、陰性對照組2的小鼠不進行攻毒。觀察并記錄21 d小鼠的死亡情況，計算sseK3缺失株的免疫保護率。

1.3統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.0和SPSS20軟件分析，實驗數(shù)據(jù)差異性分析采用t檢驗或者ANOVA分析，各組間差異比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1重組自殺性質(zhì)粒pREΔsseK3的構(gòu)建 對構(gòu)建的重組自殺性質(zhì)粒pREΔsseK3進行雙酶切，酶切出現(xiàn)兩條帶，約為5 170 bp和2 056 bp，與預(yù)期的片段大小一致(圖1)。進一步測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了重組自殺性質(zhì)粒pREΔsseK3。

圖1 重組自殺性質(zhì)粒pREΔsseK3的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombination suicide vector pRE-ΔsseK3Note: M.DL5000 DNA marker;1.Double digestion identification with XbaⅠ and KpnⅠ.

2.2sseK3缺失株的篩選及鑒定 供體菌和受體菌在經(jīng)過第一次同源重組后，通過sseK3的上臂內(nèi)部引物PsE和下臂內(nèi)部引物PsF擴增鑒定接合子，得到約為1 463 bp和455 bp共2條帶(圖2A)。接下來，陽性接合子在加入10%蔗糖的NB培養(yǎng)基上進行第二次同源重組，用引物PsE/PsF擴增出大小為455 bp和1 463 bp的兩條片段(圖2B)。使用sseK3下臂內(nèi)部引物PsF和上臂外部引物PsG通過PCR擴增陽性缺失株，從而證明同源重組發(fā)生在SL1344染色體上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型擴增出2 410 bp的片段，缺失菌株擴增出1 402 bp的片段(圖2C)。同時，生工測序結(jié)果也進一步說明成功構(gòu)建了sseK3缺失株，菌株被命名為SL1344ΔsseK3。

2.3回復菌株SL1344CΔsseK3的構(gòu)建 將回收的sseK3連接至pBR322并電轉(zhuǎn)至sseK3缺失株感受態(tài)細胞，進行PCR及雙酶切鑒定，PCR擴增出約1 008 bp片段；酶切出了大小約4 361 bp的載體條帶和約1 008 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相一致，說明sseK3回復菌株構(gòu)建成功(圖3)。

2.4sseK3缺失株生物學特性檢測sseK3缺失株的表型鑒定：血清型鑒定表明sseK3缺失菌株與親本菌株SL1344的血清型相同，均為1,4,5,12:i:1,2。生化鑒定結(jié)果表明，sseK3缺失菌株與親本菌株SL1344相比，其生化特性沒有發(fā)生明顯變化，與親本菌株SL1344保持一致。

2.5sseK3缺失株遺傳穩(wěn)定性測定 用PsG/PsF引物分別對第10、20、30、40、50、60代的sseK3缺失株的單菌落進行PCR鑒定，均得到了約1 402 bp的片段(圖4)，結(jié)果顯示，sseK3缺失株能夠穩(wěn)定遺傳。

圖2 sseK3缺失株的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of sseK3 mutant strain of Salmonella typhimuriumNote: A.PCR identification of ΔsseK3 mutant conjugants with PsE and PsF;M.DL2000 DNA Marker;1.ddH2O control;2.SL1344 control;3.ΔsseK3 mutant conjugants;4.SL1344ΔsseK3;B.PCR identification of ΔsseK3 mutant with PsE and PsF;M.DL2000 DNA Marker;1.ddH2O control;2.SL1344 control;3.SL1344ΔsseK3;C.PCR identification of ΔsseK3 mutant with PsG and PsF;M.DL5000 DNA Marker;1.ddH2O control;2.SL1344 control;3，4.SL1344ΔsseK3.

2.6sseK3缺失株生長特性鑒定sseK3缺失株、sseK3回復菌株與親本株SL1344分別經(jīng)過培養(yǎng)并計數(shù)，結(jié)果顯示，sseK3缺失株的生長速度與親本株SL1344和sseK3回復菌株無顯著差異(圖5)。

2.7sseK3缺失株半數(shù)致死量(LD50)的測定sseK3缺失株、sseK3回復菌株與親本株SL1344口服感染小鼠后，觀察小鼠的死亡情況。經(jīng)過剖檢死亡小鼠，均發(fā)現(xiàn)存在沙門菌導致的病理變化，從死亡的小鼠分離細菌，分離得到的細菌均能用pi1/pi2引物擴增出約580 bp的目的條帶，然而生理鹽水對照組中的小鼠均正常。記錄的結(jié)果通過Bliss法計算LD50，sseK3缺失株的LD50為2.96×108CFU，親本株SL1344的LD50為2.86×105CFU，sseK3回復菌株的LD50為6.16×105CFU。且sseK3缺失株與親本菌株相比，LD50值升高約1 035倍，毒力明顯下降(表2)。

圖3 回復菌株SL1344CΔsseK3的鑒定Fig.3 Identification of SL1344CΔsseK3 strainNote: A.Verification of the pBR322-sseK3 electroporated into SL1344ΔsseK3;M.DL5000 DNA Ladder;1-3.SL1344C ΔsseK3;4.ddH2O control;B.Identification of recombination SL1344 ΔsseK3(pBR322-sseK3);M.DL5000 DNA Ladder;5.ddH2O control;6.Double digestion identification with HindⅢ+BamHⅠ.

圖5 sseK3缺失株生長特性檢測Fig.5 Growth characterization of SL1344ΔsseK3 mutant

表2sseK3缺失株LD50的測定

Tab.2 Determination of LD50ofsseK3deletion strain

StrainsInoculatingdose (CFU)Total numberof miceNumber ofdeathLD50(CFU)ΔsseK35×10912102.96×1081×1091281×1081241×1071221×106120WT1×10812122.86×1051×10712101×1061281×1051241×104122Complemented1×10812126.16×1051×1071281×1061261×1051241×104122Normal saline200 μl120

2.8sseK3缺失株免疫小鼠血清特異性IgG抗體的檢測sseK3缺失株免疫組小鼠血清IgG水平與對照組相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sseK3缺失株免疫小鼠能夠一定程度上刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，而且sseK3缺失株免疫小鼠血清在免疫后的第14天，IgG抗體水平含量達到最高，在免疫后第21天，呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(圖6)。

圖6 sseK3缺失株免疫小鼠血清的IgG抗體檢測Fig.6 Detection of IgG antibody in serum of mice immunized with sseK3 deletion strainNote: Compared with control group,*.P<0.05,n=3.

2.9sseK3缺失株免疫保護率的測定 在進行強毒株SL1344攻毒后，對照組1中的所有小鼠14 d內(nèi)均死亡；在實驗組1中的2只小鼠在1～7 d死亡，2只小鼠在8～14 d死亡，其余8只直至實驗結(jié)束均正常存活，對照組2和實驗組2中的12只小鼠均存活至觀察期結(jié)束。結(jié)果顯示，sseK3缺失株對小鼠的免疫保護率為66.7%。

3 討論

鼠傷寒沙門菌是目前威脅人類健康的主要人畜共患菌之一，主要通過攝入被污染的食物和水源引發(fā)感染，有關(guān)鼠傷寒沙門菌感染的報道每年呈遞增的趨勢[7,8]。因此，近年來對鼠傷寒沙門菌致病因子的研究及減毒標記活疫苗的研發(fā)備受關(guān)注。國外已有研究發(fā)現(xiàn)，sseK3是沙門菌的一種新型轉(zhuǎn)運蛋白[5,9]，但是國內(nèi)有關(guān)sseK3基因的作用機制及其生物學特性方面的研究尚未見報道。

因此，為探索sseK3基因的功能，本研究中使用的自殺性質(zhì)粒pRE112篩選重組菌株不影響生物體的其他遺傳性狀，并且簡單、準確、快速，非常適合研究某種基因在自然生物體環(huán)境內(nèi)的功能，使用pRE112獲得的ΔsseK3缺失菌株沒有任何抗生素抗性[10]。通過同源重組、抗性篩選標記和PCR檢測技術(shù)，篩選出無任何抗性的sseK3缺失株，并對其生物學特性進行了一系列的比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sseK3缺失菌株、親本菌株和其回復菌株的生長特性與生化特性之間無顯著差異，這說明sseK3很可能不參與鼠傷寒沙門菌的代謝過程。根據(jù)小鼠LD50的比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sseK3缺失株與親本菌株相比，LD50值升高約1 035倍，表明sseK3基因缺失株的毒力較SL1344親本菌株明顯下降，sseK3與鼠傷寒沙門菌的毒力作用相關(guān)。這與Brown等[11]報道的sseK3參與沙門菌的毒力的結(jié)果相一致。對免疫小鼠血清抗體檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失株免疫組小鼠血清IgG抗體水平在免疫后呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并于免疫后第14～21天達到最高水平，表明sseK3缺失株免疫小鼠在一定程度上能夠刺激小鼠產(chǎn)生一定的抗體，對小鼠有一定的保護作用，這與陳松彪等[12]發(fā)現(xiàn)的鼠傷寒沙門菌SL1344免疫小鼠后IgG檢測結(jié)果相符。通過小鼠的免疫保護率實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sseK3缺失株免疫小鼠后用強毒株攻毒有66.7%的免疫保護率，佐證了SL1344株ΔsseK3缺失株的免疫作用?；貜途昱c親本親株生物學特性無顯著性差異，基本回復到野生型水平，這說明sseK3在鼠傷寒沙門菌發(fā)揮毒力的過程中起到了重要作用，但具體機制仍然沒有得到很好的解答。

總之，本研究成功構(gòu)建出了鼠傷寒沙門菌sseK3缺失菌株，sseK3缺失菌株、親本菌株和回復菌株的生長特性和生化特性均無顯著差異，毒力卻顯著降低，具有良好的免疫原性，因此本研究將進一步對sseK3基因的功能進行探究，這為鼠傷寒沙門菌致病島分泌蛋白的致病機制的研究提供了新思路，并為進一步評估sseK3在細菌內(nèi)發(fā)揮毒力作用的具體機制奠定基礎(chǔ)，更為其更好作為用于減毒活疫苗的候選物提供參考依據(jù)。