楊毅 張志軍

【摘 要】目的：探究肺癌細胞分泌的外泌體對順鉑的敏感性調(diào)節(jié)。方法：通過超速離心從肺癌細胞A549上清液中分離得到外泌體，采用透射電子顯微鏡（TEM）來觀察外泌體的形貌，蛋白質印跡法檢測CD63和CD81的蛋白表達；將肺癌細胞來源外泌體一組用順鉑處理，另一組不進行處理，將2組外泌體與肺癌細胞共同培養(yǎng)，然后用CCK-8法來檢測外泌體在同源細胞中對順鉑的敏感性調(diào)節(jié)過程中的作用。結果：外泌體在透射電子顯微鏡下觀察到具有盤狀的形貌，直徑約30-100nm；蛋白質印跡法顯示外泌體富含CD63和CD81蛋白；未順鉑處理的exosome干預細胞組較PBS處理的細胞組細胞存活率高4%，而順鉑處理的exosome干預細胞組較未順鉑處理的exosome干預細胞組細胞存活率高24%，P<0.05。結論：肺癌細胞來源的順鉑處理的外泌體降低了肺癌細胞對順鉑的敏感性，這可能為肺癌的化療提供一種新的靶點和思路。

【關鍵詞】肺癌；外泌體； 化療

【中圖分類號】R197 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2019）02-0091-02

Lung cancer cell-derived cisplatin-treated exosomes reduce the sensitivity of lung cancer cells to cisplatin

Yang yi Zhang zhi jun（Corresponding author）

（Center for reproductive medicine， Taihe hospital， Shiyan442000， Hubei， China）

【Abstract】Objective：To investigate the sensitivity of exosomes secreted by lung cancer cells to cisplatin. Methods：Exosomes were isolated from the supernatant of lung cancer cell A549 by ultracentrifugation. The morphology of exosomes was observed by transmission electron microscopy （TEM）. The protein expression of CD63 and CD81 was detected by Western blotting. One group was treated with cisplatin and the other group was not treated. Two groups of exosomes were co-cultured with lung cancer cells， and then CCK-8 method was used to detect the sensitivity of exosomes to cisplatin in homologous cells. The role of the adjustment process. Results：Exosomes were observed to have a disk-like morphology under transmission electron microscopy with a diameter of about 30-100 nm. Western blotting showed that exosomes were rich in CD63 and CD81 proteins. The non-cisplatin-treated exosome intervention cell group had a 4% higher cell viability than the PBS-treated cell group， while the cisplatin-treated exosome intervention cell group had a 24% higher cell viability than the non-cisplatin-treated exosome intervention cell group， P < 0.05. Conclusion：Lung cancer cell-derived cisplatin-treated exosomes reduce the sensitivity of lung cancer cells to cisplatin， which may provide a new target and idea for chemotherapy of lung cancer.

【Key word】Lung cancer； Exosome； Chemotherapy

肺癌的發(fā)病率和致死率在所有惡性腫瘤中居于首位，并且逐年上升，嚴重危害著人民健康。肺癌起病隱匿，病情發(fā)展迅速，影響肺癌預后的最主要因素是分期，約75%～85%的肺癌患者在診斷時就已屬晚期，失去徹底切除機會[1-3]。外泌體（exosome，Exo）是由多種細胞如樹突狀細胞、腫瘤細胞等經(jīng)內(nèi)吞逆出芽形成許多小囊泡，直徑約30～100nm。它可以在不直接接觸的情況下完成細胞間生物信號傳導[4]。本研究成功從肺癌細胞中提出外泌體，并揭示了肺癌細胞來源的外泌體能調(diào)節(jié)肺癌細胞對順鉑化療敏感性，這為肺癌的治療提供了一種新的思路和靶點

1 資料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 肺癌細胞A549 購于上海細胞庫。將其接種到培養(yǎng)液中37 ℃、5 % CO2的恒溫箱內(nèi)150rpm培養(yǎng)，培養(yǎng)48h傳代一次。培養(yǎng)液成分：RPMI 1640培養(yǎng)液中添加10U/L慶大霉素和10% 滅活胎牛血清。

1.2提取exosomes、電鏡制樣和檢測蛋白表達 收集培養(yǎng)48h后的培養(yǎng)液上清液，將上清液用離心機多次離心去除胞體和碎片雜質，取濃縮液，在4℃下繼續(xù)離心得到的下層沉淀即是exosomes。

將得到的exosomes沉淀溶解稀釋，取20ul滴到銅網(wǎng)，室溫下晾干，即可置于透射掃描電鏡下進行觀察并拍攝照片。

1.3CCK-8法檢測細胞的存活率 將A549肺癌細胞（對數(shù)生長期）接種到96 孔板中（ 細胞數(shù)約6×103個/孔），24h后加入不同濃度梯度的順鉑（濃度為0-10μg/ml），培養(yǎng)48h。每孔加入100ul1：9的CCK-8和培養(yǎng)液，30min后，用紫外可見光分光儀在450nm波長下測吸光度。

1.4統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料應用平均值±標準差（ ），計量資料組間比較采用對照組獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以百分率（%）表示，采用x2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1肺癌細胞A549來源exosomes形態(tài)和蛋白表達

從透射顯微電鏡圖中可以達到Exosome的形態(tài)為圓盤狀（圖1A），直徑約為30-100nm，大小尺寸為納米級。從圖1B中可以發(fā)現(xiàn)具有特異性表達CD63和CD81蛋白，這證明我們提取的是細胞分泌到細胞外的exosomes，而不是其他物質，提取成功。

2.2exosome對順鉑敏感性調(diào)解過程中的影響

不同濃度梯度的順鉑對肺癌細胞有一定的抑制作用，濃度越大，細胞存活率就越低，在3ug/ml的順鉑濃度時，細胞存活率為50%（圖2）。分別用順鉑處理過的exosome和順鉑處理的exosome預處理細胞，并與對照PBS組作比較（圖3）。未順鉑處理的exosome干預細胞組較PBS處理的細胞組細胞存活率高4%，而順鉑處理的exosome干預細胞組較未順鉑處理的exosome干預細胞組細胞存活率高24%。

3 討論

自1987年，Johnstone等首次觀察到外泌體，成功分離純化并命名為exosomes之后，外泌體的研究引起了廣泛的關注。2001年，有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的外泌體（tumor-derived exosome，TEX）表面富含腫瘤抗原，可使細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）主動殺傷腫瘤細胞[5]。由此，Exo在腫瘤領域的研究逐漸推上了熱潮。Exo也被看作是一種熱休克蛋白的載體，熱休克蛋白（Hsp）可在各種應激狀態(tài)下被誘導，作為一種“危險信號”誘發(fā)機體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應答，又稱為應激蛋白[6]。此研究顯示，抑制肺癌細胞Exo的生成或釋放將為肺癌的治療提供新的方法。

本研究通過透射電子顯微鏡觀察到了肺癌細胞A549分泌的exosome的形態(tài)為圓盤狀，蛋白質印跡法也順利檢測到CD63和CD81兩種特異性蛋白質。CCK-8法檢測到的細胞成活率明顯經(jīng)順鉑處理組要比未經(jīng)順鉑處理組要高。這說明exosome會影響同源細胞對順鉑敏感性有所降低，不利于癌癥患者順鉑化療的治療。

綜上所述，肺癌細胞分泌的exosome可以在細胞間傳遞信息，導致同源細胞對順鉑敏感性的降低。換句話說，減少exosome的分泌和細胞間的傳遞可以增加順鉑化療的敏感性和療效，可以在治療肺癌藥物研究中加以應用，是一種新的治療思路。

參考文獻

[1]M.J.Tsai，etal.Cysteinyl leukotriene receptor antagonists decrease cancer risk in asthma patients.Sci. Rep.6（2016），23979.

[2]KOSAKA N. Decoding the secret of cancer by means of extracellular vesicles[J]. J Clin Med，2016，5（2）：22.

[3]Ana Lukic ， Casper J.E. Wahlund ， Cristina Gómeza， Daniel Brodin ， Bengt Samuelsson ， Craig E. Wheelock ， Susanne Gabrielssonb， Olof R?dmark.Exosomes and cells from lung cancer pleural exudates transform LTC4 to LTD4， promoting cell migration and survival via CysLT1.Cancer Letters. 2019，444，1-8.

[4]LiZhou， Tang feng， LvQun Zhang， Qingqing Zhu， Ping Zhan， Suhua Zhu， Jianya Zhang， Yong Song.The biology， function and clinical implications of exosomes in lung cancerCancerLetters，2017，407，84-92.

[5]解世林，曲晶磊，范一博，等.Akt和SRC在Exosomes促進同源肺癌細胞遷移中的作用[J].中國醫(yī)科大學學報，2017，46（04）：294-297.

[6]Y. Liu， etal.Tumor exosomal RNAs promote lung pre-metastatic niche formation by activating alveolar epithelial TLR3 to recruit neutrophils， Cancer Cell. 2016，30 （2）：243–256.

十堰市科技局項目

項目名稱 ：Exosomes對肺癌發(fā)生發(fā)展的影響和機制的研究（項目編號：18Y40）