鄭 超,田作春,馬繼鵬,蘇永超

(1海南省第三人民醫(yī)院心胸外科,三亞 572000;2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科;*通訊作者,E-mail:zhengchaosanya@126.com)

在過去的30年中,隨著化療、手術(shù)、放療等抗癌技術(shù)和手段的不斷進(jìn)展,癌癥死亡率已顯著下降,同時(shí)癌癥幸存者數(shù)量也迅速增加[1]。許多癌癥幸存者在抗癌治療后會(huì)并發(fā)心臟并發(fā)癥,而且心臟并發(fā)癥已成為該類人群繼惡性腫瘤復(fù)發(fā)之后的第二大死亡原因[2]?？拱┲委熛嚓P(guān)心臟毒副作用的典例是由蒽環(huán)類阿霉素(doxorubicin,DOX,又稱多柔比星)引起的心肌損傷[3]。阿霉素在臨床上廣泛應(yīng)用于治療乳腺癌、淋巴瘤和白血病等多種腫瘤[4]。近幾十年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于阿霉素心臟毒性的具體分子機(jī)制進(jìn)行了深入探討。研究證實(shí),DOX可通過形成拓?fù)洚悩?gòu)酶2β-DOX-DNA三元切割復(fù)合物誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂,導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[3]。此外,DOX還可選擇性蓄積于線粒體中,增加線粒體鐵水平并誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生,誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷[5]。因此,尋找藥物干預(yù)氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡是改善阿霉素心臟毒性的潛在策略。

水飛薊賓(silibinin,SIL)是從水飛薊中提取出的一種多酚類黃酮抗氧化劑,具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等生物學(xué)作用,其生物學(xué)作用的發(fā)揮與線粒體密切相關(guān)[6,7]。以往研究表明,水飛薊賓能夠明顯減輕阿霉素引起的心臟毒性,但其具體下游分子機(jī)制尚未完全闡明[8]。沉默信息調(diào)控因子3(silent information regulator 3,SIRT3)是線粒體內(nèi)最主要的去乙?；?可通過去乙酰化修飾作用參與調(diào)節(jié)線粒體氧化應(yīng)激、能量代謝、線粒體途徑凋亡等多種病理生理過程[9]。據(jù)此,我們推測(cè)水飛薊賓緩解阿霉素心臟毒性的作用可能與SIRT3有關(guān)。本研究旨在探究水飛薊賓是否通過激活SIRT3信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而緩解阿霉素心臟毒性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

水飛薊賓(貨號(hào):02000585)購(gòu)自Sigma公司(美國(guó));DOX(貨號(hào):15007)購(gòu)自Cayman公司(美國(guó));二氫乙錠(Dihydroethidium,DHE)染料購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó));抗SIRT3、Ac-SOD2抗體購(gòu)自Abcam公司(美國(guó));抗SOD2抗體購(gòu)自Santa-Cruz公司(美國(guó));抗Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3和β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司(美國(guó));羊抗兔、羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司(中國(guó))。雄性C57BL/6小鼠(8-10周齡),購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(中國(guó)),動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境,自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理方式

將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為6組,即正常組(control組):腹腔注射生理鹽水0.2 ml后每日灌胃0.2 ml生理鹽水,灌胃5 d;單純水飛薊賓處理組(SIL組):腹腔注射生理鹽水0.2 ml后每日僅灌胃給藥水飛薊賓(100 mg/kg),灌胃5 d;阿霉素處理組(DOX組):腹腔單次注射阿霉素(15 mg/kg,0.2 ml)后每日僅灌胃0.2 ml生理鹽水,灌胃5 d;水飛薊賓+阿霉素處理(SIL+DOX組):腹腔單次注射阿霉素(15 mg/kg,0.2 ml)后每日僅灌胃給藥水飛薊賓(100 mg/kg),灌胃5 d;3-TYP(SIRT3抑制劑)+水飛薊賓+阿霉素(3-TYP+SIL+DOX)組:先腹腔注射3-TYP 50 mg/(kg·d) 3 d后,再通過腹腔單次注射阿霉素(15 mg/kg,0.2 ml),而后每日僅灌胃給藥水飛薊賓(100 mg/kg),灌胃5 d;3-TYP+阿霉素(3-TYP+DOX)組:先腹腔注射3-TYP 50 mg/(kg·d) 3 d后,再通過腹腔單次注射阿霉素(15 mg/kg,0.2 ml),而后每日僅灌胃0.2 ml生理鹽水,灌胃5 d。

1.3 在體心臟血流動(dòng)力檢測(cè)

阿霉素處理5 d后,將小鼠用異氟醚(2%誘導(dǎo),1.5%維持)麻醉,用微壓力導(dǎo)管(Millar Instruments公司,型號(hào)SPR-839,1.4 F)從小鼠右頸動(dòng)脈插管至左心室。使用Chart 5軟件(AD Instruments公司)和Power Lab模數(shù)轉(zhuǎn)換器記錄左室收縮壓最大上升速率(+dP/dt)和左室收縮壓最大下降速率(-dP/dt)。具體操作流程參考文獻(xiàn)[10]所述方法。

1.4 心肌組織HE染色

阿霉素處理5 d后,將小鼠頸椎脫臼處死,取心臟并于10%福爾馬林中固定48 h。脫水至蠟包埋后將組織蠟塊切成5 μm厚度組織切片。將組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌病理改變。

1.5 心肌組織凋亡檢測(cè)

根據(jù)試劑盒說明書使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(Roche公司)對(duì)心肌組織石蠟切片進(jìn)行TUNEL染色。DAPI染色用于檢測(cè)所有細(xì)胞核。凋亡率表示為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%。

1.6 Western blotting檢測(cè)Bax、cleaved Caspase-3、Bcl-2、SIRT3和Ac-SOD2的表達(dá)量

用含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑(Thermo Scientific公司)的RIPA緩沖液從心肌組織中提取蛋白質(zhì),通過SDS-PAGE凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,并將以下抗體在4 ℃孵育過夜:抗SIRT3(稀釋比1 ∶1 000)、Ac-SOD2(稀釋比1 ∶1 000)、SOD2(稀釋比1 ∶500)、Bax(稀釋比1 ∶1 000)、Bcl-2(稀釋比1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(稀釋比1 ∶1 000)和β-actin(稀釋比1 ∶1 000)抗體。室溫孵育羊抗兔、羊抗鼠二抗(稀釋比1 ∶5 000)2 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒和BioRad成像系統(tǒng)檢測(cè)各組蛋白表達(dá)情況。

1.7 心肌ROS產(chǎn)量測(cè)定

阿霉素處理5 d后,將液氮速凍的心臟用冰凍切片機(jī)切成10 μm厚切片。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行心肌冰凍切片DHE染色,用熒光顯微鏡拍照后用Image J軟件分析各切片熒光強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 水飛薊賓能改善阿霉素引起的心肌“空泡化”變性和心功能障礙

HE染色結(jié)果顯示,control組小鼠心肌細(xì)胞未發(fā)生“空泡化”變性。單純給予正常小鼠水飛薊賓處理不引起心肌發(fā)生“空泡化”變性。而阿霉素處理5 d后,心肌組織出現(xiàn)明顯“空泡化”變性。水飛薊賓處理能夠明顯緩解阿霉素誘發(fā)的心肌“空泡化”變性(見圖1)。Millar導(dǎo)管檢測(cè)結(jié)果顯示,單純給予正常小鼠水飛薊賓處理對(duì)心臟收縮和舒張功能無明顯影響,表現(xiàn)為SIL組與control組相比,+dP/dt、-dP/dt均無明顯差異(P>0.05)。阿霉素處理5 d后,小鼠心肌收縮和舒張功能均明顯減弱,表現(xiàn)為與control組相比,+dP/dt和-dP/dt均明顯降低(P<0.05)。而水飛薊賓處理能夠明顯緩解阿霉素引起的心肌收縮和舒張功能障礙,表現(xiàn)為與DOX組相比,+dP/dt、-dP/dt均明顯提高(P<0.05,見圖2)。

圖1 水飛薊賓對(duì)阿霉素處理后小鼠心肌細(xì)胞“空泡化”變性的影響 (HE,×400)Figure 1 Effects of silibinin treatment on vacuolar degeneration in cardiomyocytes in doxorubicin-induced mice (HE,×400)

與control組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05圖2 水飛薊賓對(duì)阿霉素處理后心臟收縮和舒張功能的影響 (n=6)Figure 2 Effects of silibinin treatment on cardiac systolic and diastolic function in doxorubicin-treated mice (n=6)

2.2 水飛薊賓能降低阿霉素處理后心肌組織ROS產(chǎn)量

DHE染色結(jié)果顯示,單純給予正常小鼠水飛薊賓處理對(duì)心肌組織ROS產(chǎn)量無明顯影響(P>0.05)。阿霉素處理5 d后,心肌組織內(nèi)ROS產(chǎn)量明顯增加(P<0.05)。而水飛薊賓可以明顯降低阿霉素處理后心肌組織內(nèi)ROS產(chǎn)量(P<0.05,見圖3)。

與control組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05圖3 水飛薊賓對(duì)阿霉素處理后小鼠心肌組織ROS產(chǎn)量的影響 (n=6)Figure 3 Effects of silibinin treatment on myocardial ROS production in doxorubicin-treated mice (n=6)

2.3 水飛薊賓能抑制阿霉素處理后心肌細(xì)胞凋亡

TUNEL染色結(jié)果顯示,單純給予正常小鼠水飛薊賓處理對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率無明顯影響(P>0.05)。阿霉素處理5 d后,心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。而水飛薊賓可以明顯降低阿霉素處理后心肌細(xì)胞凋亡率(P<0.05,見圖4)。此外,凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況顯示,單純給予正常小鼠水飛薊賓處理對(duì)心肌組織Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的表達(dá)量無明顯影響(P>0.05)。阿霉素處理5 d后,心肌組織Bax和cleaved Caspase-3的表達(dá)量明顯增加,而Bcl-2表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。而水飛薊賓可以明顯降低阿霉素處理后心肌組織Bax和cleaved Caspase-3的表達(dá)量,提高Bcl-2表達(dá)量(P<0.05,見圖5)。

圖4 水飛薊賓對(duì)阿霉素處理后心肌凋亡率的影響 (TUNEL,×400)Figure 4 Effects of silibinin treatment on myocardial apoptotic rate in doxorubicin-treated mice (TUNEL,×400)

1.control組;2.SIL組；3.DOX組；4.SIL+DOX組;與control組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05圖5 水飛薊賓對(duì)阿霉素處理后心臟Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3表達(dá)情況的影響 (n=6)Figure 5 Effects of silibinin treatment on the expression levels of Bax, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 in the heart of doxorubicin-treated mice (n=6)

2.4 水飛薊賓能激活阿霉素處理后心肌SIRT3信號(hào)通路

單純給予正常小鼠水飛薊賓處理對(duì)心肌SIRT3表達(dá)量以及SOD2的乙?；綗o明顯影響(P>0.05)。阿霉素處理5 d后,心肌組織SIRT3表達(dá)量明顯降低,而Ac-SOD2表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。而水飛薊賓處理可以明顯提高阿霉素處理后心肌SIRT3表達(dá)量,降低Ac-SOD2表達(dá)量(P<0.05,見圖6)。

2.5 3-TYP明顯削弱水飛薊賓抵抗阿霉素心臟毒性保護(hù)作用

HE染色結(jié)果顯示,與SIL+DOX組相比,3-TYP+SIL+DOX組心肌細(xì)胞“空泡化”變性明顯加重(P<0.05,見圖7)。Millar導(dǎo)管檢測(cè)結(jié)果顯示,與SIL+DOX組相比,3-TYP+SIL+DOX組心肌收縮和舒張功能明顯降低,表現(xiàn)為+dP/dt和-dP/dt明顯降低(P<0.05)。DHE染色結(jié)果顯示,與SIL+DOX組相比,3-TYP+SIL+DOX組心肌ROS產(chǎn)量明顯增高(P<0.05,見圖8)。TUNEL染色和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,與SIL+DOX組相比,3-TYP+SIL+DOX組心肌凋亡率、Bax和cleaved Caspase-3的表達(dá)量明顯增加,而Bcl-2表達(dá)量明顯降低(P<0.05,見圖9,10)。與DOX組相比,3-TYP+DOX組小鼠的上述指標(biāo)無明顯差異(P>0.05)。

1.control組;2.SIL組；3.DOX組；4.SIL+DOX組;與control組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05圖6 水飛薊賓對(duì)心肌組織SIRT3信號(hào)通路的影響 (n=6)Figure 6 Effect of silibinin treatment on SIRT3 signaling pathway in heart tissues (n=6)

3 討論

阿霉素是臨床上廣泛應(yīng)用的一種強(qiáng)效廣譜化療藥物,可用于治療多種癌癥[4]。然而,阿霉素超過一定劑量后即可引發(fā)心臟毒性,可導(dǎo)致化療患者發(fā)生充血性心衰甚至猝死[11]。阿霉素心臟毒性已經(jīng)成為限制阿霉素臨床應(yīng)用的最主要因素。迄今為止,FDA唯一批準(zhǔn)的用于蒽環(huán)類化療心臟保護(hù)的藥物是右丙亞胺,右丙亞胺可通過誘導(dǎo)拓?fù)洚悩?gòu)酶2β的蛋白酶體降解以及降低線粒體鐵離子水平來發(fā)揮心肌保護(hù)作用[2,5]。然而,由于右丙亞胺可能會(huì)損害蒽環(huán)類化療藥物的抗腫瘤活性[2],因此亟需尋找新的心肌保護(hù)藥物改善化療患者心臟并發(fā)癥。

水飛薊賓是從水飛薊中提取出的一種有效活性成分。越來越多研究[6-8,12]表明,水飛薊賓能夠有效改善多種心血管疾病。Muthumani等[6]證實(shí),水飛薊賓可通過減輕氧化應(yīng)激損傷和改善血脂代謝異常緩解亞砷酸鈉誘導(dǎo)的心臟毒性。Anestopoulos等[12]發(fā)現(xiàn),水飛薊賓可通過調(diào)解ERK1/2和Akt信號(hào)通路激活抗氧化機(jī)制減弱去氧腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。Zhou等[7]證實(shí),水飛薊賓可通過抑制caspase途徑和下調(diào)p53表達(dá)保護(hù)心肌細(xì)胞免受異丙腎上腺素誘導(dǎo)的DNA損傷。此外,水飛薊賓能夠改善阿霉素引起的大鼠心臟損傷[8],但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。值得注意的是,充分證據(jù)顯示,水飛薊賓具有抗氧化和抗凋亡生物活性。Song等[13]發(fā)現(xiàn),水飛薊賓可通過抑制β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的阿爾茲海默病大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷和調(diào)節(jié)自噬,從而緩解阿爾茲海默病大鼠記憶缺陷。Jiang等[14]發(fā)現(xiàn),水飛薊賓可明顯抑制過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡。Bouderba等[15]證實(shí),水飛薊賓治療可緩解代謝綜合征大鼠代謝功能障礙,降低胰島素抵抗,并提高抗氧化能力。Zhou等[7]證實(shí),水飛薊賓可抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。在該研究中,我們發(fā)現(xiàn),水飛薊賓可明顯減輕阿霉素引起的心肌“空泡化”變性,改善阿霉素對(duì)小鼠心臟收縮和舒張功能的損害。此外,水飛薊賓還可有效抑制阿霉素引起的ROS產(chǎn)量,降低心肌細(xì)胞凋亡率,降低Bax表達(dá),抑制Caspase-3的激活,提高Bcl-2的表達(dá)。以上結(jié)果提示,水飛薊賓可能通過抗氧化和抗凋亡發(fā)揮抗阿霉素心臟毒性作用。

SIRT3是線粒體內(nèi)最主要的去乙?；?近年來SIRT3的心肌保護(hù)作用越來越受到關(guān)注。充分證據(jù)顯示,SIRT3在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激狀態(tài)和細(xì)胞凋亡方面也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。SIRT3一方面可通過調(diào)節(jié)電子傳遞鏈關(guān)鍵蛋白的乙?；?穩(wěn)定氧化呼吸鏈從而從源頭上減少ROS產(chǎn)量;另一方面,SIRT3還可通過提高抗氧化酶如SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的抗氧化應(yīng)激能力,清除過量產(chǎn)生的ROS,抑制氧化應(yīng)激損傷[16]。此外,SIRT3可抑制Bax的線粒體轉(zhuǎn)位,從而抑制心肌缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡[17]。激活SIRT3信號(hào)通路已被證實(shí)能有效緩解心肌缺血再灌注損傷[17]、心梗[18]、心肌纖維化[19]、壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚[20]等心血管疾病。特別值得注意的是,SIRT3已經(jīng)成為治療阿霉素心臟毒性的重要作用靶點(diǎn)。多項(xiàng)研究證實(shí),DOX處理后小鼠和大鼠心臟中SIRT3的表達(dá)量明顯降低,而線粒體蛋白的乙酰化水平明顯增高[21-23]。上調(diào)SIRT3的表達(dá)量或活性是緩解阿霉素心臟毒性的有效策略。Cheung等[22]發(fā)現(xiàn),DOX和白藜蘆醇共處理可以明顯緩解DOX對(duì)SIRT3表達(dá)的抑制,減輕了H9c2細(xì)胞和小鼠心臟中蛋白質(zhì)乙酰化水平和線粒體ROS產(chǎn)量。而敲除SIRT3基因后,白藜蘆醇的保護(hù)作用明顯減弱,提示SIRT3是介導(dǎo)白藜蘆醇抗阿霉素心臟毒性的關(guān)鍵靶點(diǎn)。DOX處理能明顯降低新生大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位并導(dǎo)致線粒體DNA損傷,而過表達(dá)SIRT3可明顯減弱DOX誘發(fā)的線粒體損傷[21]。Pillai等[24]證實(shí),和厚樸酚可通過激活SIRT3信號(hào)通路,抑制阿霉素誘導(dǎo)的大鼠新生心肌細(xì)胞產(chǎn)生ROS、線粒體損傷和細(xì)胞凋亡,促進(jìn)線粒體融合,從而緩解阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷。Coelho等[25]發(fā)現(xiàn),小檗堿預(yù)處理能夠上調(diào)DOX處理后SIRT3的蛋白表達(dá)水平并抑制DOX誘導(dǎo)的Caspase-9和Caspase-3樣激活。在該研究中,我們發(fā)現(xiàn),阿霉素處理后小鼠心肌組織SIRT3表達(dá)量和活性均明顯受損,伴隨ROS產(chǎn)量和心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加。而水飛薊賓共處理后SIRT3表達(dá)量和活性均明顯增加,并可抑制阿霉素處理后心肌組織內(nèi)ROS產(chǎn)量和凋亡情況。阻斷SIRT3信號(hào)通路后,水飛薊賓的上述心肌保護(hù)作用明顯減弱。

與DOX組比較,#P<0.05;與SIL+DOX組比較,*P<0.05圖8 水飛薊賓和3-TYP對(duì)阿霉素處理后心臟收縮舒張功能以及ROS產(chǎn)量的影響 (n=6)Figure 8 Effects of silibinin and 3-TYP on cardiac systolic and diastolic function and ROS production in doxorubicin-treated mice (n=6)

圖9 水飛薊賓和3-TYP對(duì)阿霉素處理后心肌凋亡率的影響 (TUNEL,×400)Figure 9 Effects of silibinin and 3-TYP on the apoptosis in the hearts of doxorubicin-treated mice (TUNEL,×400)

1.DOX組；2.SIL+DOX組；3.3-TYP+SIL+DOX組；4.3-TYP+DOX組;與DOX組比較,#P<0.05;與SIL+DOX組比較,*P<0.05圖10 水飛薊賓和3-TYP對(duì)阿霉素處理后Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3表達(dá)情況的影響 (n=6)Figure 10 Effects of silibinin and 3-TYP on the expression of Bax, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 in the hearts of doxorubicin-treated mice (n=6)

綜上所述,該研究證實(shí)水飛薊賓可通過抑制氧化應(yīng)激損傷和心肌凋亡緩解阿霉素心臟毒性,且其保護(hù)作用主要由SIRT3信號(hào)介導(dǎo)。該研究為進(jìn)一步探究水飛薊賓緩解阿霉素心臟毒性的分子機(jī)制以及臨床應(yīng)用奠定了的理論基礎(chǔ)。