王 方,席 爽,逯 宜

(1西安交通大學口腔醫(yī)院,陜西省顱頜面精準醫(yī)學研究重點實驗室,西安 710004;2西安交通大學口腔醫(yī)院口腔修復科;*通訊作者,E-mail:xjtuff@126.com)

齲壞、牙周炎、創(chuàng)傷等原因導致的牙列缺損或缺失會損害患者咀嚼功能及美觀,并降低患者生活質量[1,2]。同其他組織工程一樣,支架材料在牙本質再生過程中提供新組織生成的物理及生化支持[3,4]。組織工程材料對牙再生的意義非凡[5]。現有人造成牙相關支架材料缺乏成牙誘導因素,包括各種化學因子及材料表面微結構的誘導,導致很難再生出滿足臨床需求的牙本質組織。

牙本質中的生物活性物質是經成牙本質細胞分泌并儲存在牙本質結構中,成牙本質細胞外的理化微環(huán)境對誘導牙源性細胞的牙再生能力具有重要意義。生物體自身的細胞外基質及所處的微環(huán)境對生物體的細胞行為具有重要的誘導作用。在牙組織工程中,牙本質基質富含成牙相關生物活性因子和適宜牙源性細胞生長的微結構,可以為多種牙源性細胞提供良好的成牙誘導微環(huán)境,促進牙源性細胞發(fā)揮功能[6]。大量的新鮮離體牙可為制備牙本質基質提供豐富的來源[7]。

如何有效保存和利用牙本質基質的生物活性物質和結構為牙組織工程提供理想的支架材料是牙組織工程的熱點問題之一。有研究顯示，乙二胺四乙酸(EDTA)表面脫礦處理能夠使膠原纖維暴露并且可以改善牙本質的滲透性，增加牙本質生物活性物質的釋放。經EDTA處理的牙體組織可釋放成牙活性物質，營造良好的誘導微環(huán)境[8-10]。經過冷凍干燥處理的材料在密封處理后能在20 ℃左右或4 ℃長期儲存。經冷凍干燥處理，材料可以維持凍干處理前的形態(tài)、構造及性質，方便儲藏運輸，具有廣闊的前景。為了提高生物產品的長期穩(wěn)定性，冷凍干燥同種異體牙本質粉作為骨再生材料已成功應用于牙周骨缺損患者的臨床治療[11]。

本研究探討了凍干牙本質支架材料(FD)相關性能及其對牙髓干細胞(DPSCs)細胞活性及形態(tài)的影響,初步為牙本質基質支架材料的臨床應用轉化奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人未經處理的新鮮拔除牙(西安交通大學口腔醫(yī)院);羥基磷灰石-磷酸三鈣支架材料(HA,四川大學);胎牛血清;α-MEM培養(yǎng)液(Gibco,美國);谷氨酰胺(Gibco,美國);羅丹明-鬼筆環(huán)肽(Sigma,USA);DAPI(Sigma,美國);蘇木精-伊紅(Sigma,USA);Collagen type I ELISA kit(上海巧伊,中國);propidium iodide(PI)(Sigma,USA)。真空冷凍干燥機(Osterode/Harz,德國);酶標儀(BioTek,USA);激光共聚焦顯微鏡(Olympus,日本);Matlab軟件(MathWorks,USA);EZTest/CE萬能材料實驗機(SHIMADZU,Japan)。

1.2 FD的制備

將人未經處理的新鮮拔除牙牙齒在-80 ℃中保存3個月以上，刮除牙周組織及牙髓組織后，將牙體組織置入超聲清洗機中超聲震蕩清洗5 min，將清潔后的牙體組織表面采用EDTA梯度脫礦處理，-80 ℃預凍2 h，將預凍完成的牙體組織置于真空冷凍干燥機內，真空度0.06 mbar，冷井溫度-54 ℃，置物倉-30 ℃的條件下，冷凍干燥72 h。輻照滅菌后可長期儲存，用于后續(xù)力學及細胞學實驗(見圖1)。

A.新鮮拔除牙;B.冷凍干燥處理后牙體組織圖1 新鮮拔除牙冷凍干燥處理前后對比圖Figure 1 Tooth before and after low temperature storage and freeze drying treatment

1.3 撓曲強度檢測

人牙本質組織體積較小,測量材料撓曲強度的通用配件無法用于測定小體積的人牙本質樣本。為此,本研究特制了檢測人牙本質的三點彎曲配件,用來檢測牙本質的撓曲強度。該配件由上部配件及下部配件相對組成,上部配件為單個金屬壓頭,下部配件為兩個間隔5.5 mm的金屬壓頭組成,上部壓頭位于兩個下部壓頭的中央。下部壓頭的上端為弧形,在測量過程中可起到集中壓力的作用(見圖2)。測量前,將牙本質小柱垂直搭在兩個下部配件壓頭上,放置時,盡量使兩個壓頭外側的牙本質小柱長度相等。測量時,上部配件以1 mm/min的速度緩緩下降,直至接觸牙本質小柱,將撓度強度測試數據輸入Matlab軟件,并制作凍干牙本質(FD)、未處理牙本質(D)及羥基磷灰石-磷酸三鈣(HA)三組的應力-應變曲線。

1.4 材料結構的組織學檢測

對采用1.2方法制備的凍干牙本質生物活性材料(FD)和未凍干處理牙本質(D)兩組材料進行組織學染色處理,對獲得的組織學切片篩選各組材料不同角度的牙本質小管剖面的差異進一步觀察。

圖2 撓曲強度檢測示意及定制配件(左下圖)Figure 2 Flexural strength test and costumized fittings shown below left

1.5 膠原釋放能力檢測

采用ELISA法測定FD、未處理牙本質(D)、HA中Ⅰ型膠原(COL-1)的釋放能力。將FD與未處理牙本質(D)置入液氮,經液氮冷卻,材料的脆性增加,將研磨后獲得的粉樣材料等量分裝,將HA粉末狀按相同質量分裝,三組粉末滅菌儲存。每組材料按粉液(α-MEM培養(yǎng)液)比2 g ∶10 ml的比例配制,不加材料粉末的α-MEM培養(yǎng)液為對照組。將加入α-MEM培養(yǎng)液的FD組、D組、HA組和α-MEM組置入孵箱,分別在1,2,3,4,5,6,7 d取經過濾的上清液,按照ELISA檢測說明書進行檢測。采用ELISA法測定兩個牙本質組及HA組材料的吸光度(450 nm波長),并繪制標準曲線,計算樣本數值。

1.6 人牙髓干細胞(DPSCs)的獲取及培養(yǎng)

用滅菌高速牙科手機沿牙體長軸的方向磨一道長溝,將滅菌小鑿抵住長溝,用力鑿開牙體組織,拔髓針拔髓,采用組織塊法結合酶消化法將獲得的牙髓細胞及組織置于含15% FBS的α-MEM中培養(yǎng)。

1.7 材料表面DPSCs細胞骨架形態(tài)檢測

采用細胞骨架免疫熒光染色法檢測各組材料(FD、D、HA、玻片)對實驗細胞骨架形態(tài)的影響。DPSCs在四組材料表面培養(yǎng)17 h,進行固定,漂洗,Triton X-100破膜,PBS漂洗,1%BSA封閉1 h,PBS漂洗,37 ℃下phalloidin-rhodamine避光孵化1 h,PBS漂洗,DAPI復染5 min,PBS漂洗,封片后觀察細胞骨架蛋白的特點。

1.8 不同材料對DPSCs細胞周期的影響

將DPSCs分別接種于FD、D、HA及玻片材料,分別置入含15% FBS的α-MEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)3 d后,胰蛋白酶分別消化各組材料表面的DPSCs,經碘化丙啶染色,采用流式細胞儀分析材料表面DPSCs的細胞周期分布。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 撓曲強度檢測結果

應力-應變曲線顯示，D組的斷裂應力略大于FD組，遠大于HA組；在同一應變值下，D組加載應力高于FD組。D組撓曲強度為(194.1±24.3)MPa,FD組撓曲強度為(166.1±57.5)MPa,HA組撓曲強度為(6.2±0.2)MPa。彈性模量D組為(5.8±2.1)GPa,FD組為(4.7±1.5)GPa,HA組為(0.05±0.01)GPa。從撓曲強度實驗結果可以看出,FD組的撓曲強度及彈性模量較D組略低,但差異無統(tǒng)計學意義,而HA組顯著低于其他兩組,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖3)。

FD:凍干牙本質;D:未處理牙本質;HA:羥基磷灰石-磷酸三鈣;與HA組比較,**P<0.01圖3 三組材料的力學性能檢測Figure 3 Mechanical properties testing of materials in three groups

2.2 處理前后不同剖面牙體組織學檢測結果

不同角度方向的FD組與未處理牙本質組(D組)材料的HE染色結果顯示,FD組與D組牙本質小管結構清晰,凍干處理未明顯改變牙本質小管的組織結構(見圖4)。

圖4 FD與D組牙本質小管的HE染色結果Figure 4 HE staining results of FD and D

2.3 膠原釋放能力檢測結果

兩個牙本質組液體能通過ELISA法檢測出COL1的存在,而HA組和α-MEM組均無Ⅰ型膠原檢出。COL1在各牙本質組的含量除第5天兩組具有統(tǒng)計學差異,其余時間冷凍干燥處理對牙本質的膠原釋放能力差異無統(tǒng)計學意義(見圖5)。

與D組比較，*P<0.05圖5 兩個牙本質組的Ⅰ型膠原檢測吸光度值Figure 5 Type Ⅰ collagen detection values in two dentin groups

2.4 細胞周期檢測結果

流式細胞術測定FD、D、HA及玻片表面DPSCs的細胞周期分布特點為:S+G2/M相的細胞百分比最低組和最高組分別為HA組α-MEM組,兩個牙本質組S+G2/M相的細胞百分比相似,差異無統(tǒng)計學意義(見圖6)。

2.5 各組材料表面DPSCs的肌動蛋白熒光檢測結果

細胞肌動蛋白熒光強度和結構可反應細胞骨架的張力、范圍及細胞和支架材料的關系。兩個牙本質組肌動蛋白熒光粗大清晰、密集,且DPSCs間的肌動蛋白熒光可見重疊區(qū)域;而HA組及玻片組的牙髓干細胞肌動蛋白熒光不清晰,強度較弱,細胞間的交通也較欠缺(見圖7)。

3 討論

牙本質具有合適的機械性能并含有豐富的成牙相關活性物質,是一種適合牙再生的組織工程生物支架材料。有明確證據顯示脫礦牙本質材料可用于牙再生[12]。然而牙本質生物材料保存方法的不足阻礙了這些研究成果的臨床轉化。冷凍干燥能夠延長生物制品儲存的長期穩(wěn)定性,保存材料原本的理化性能并具有降低免疫原性的作用,結合可接受的處理費用使得冷凍干燥技術能夠用于牙本質基質生物材料的制備中。實驗結果顯示,本研究制備的FD具有與未處理牙本質類似的理化性能,且對DPSCs的細胞活性及骨架蛋白結構具有積極作用。

牙本質的力學性能優(yōu)越,能夠在一定程度上抵御和降低牙合力對牙齒的沖擊。許多牙科充填材料及全瓷材料的研制均希望達到牙本質相似的力學性能。許多細胞支架材料的開發(fā)也著重于與牙本質組織有相似的性能。

圖6 FD、D、HA及α-MEM組DPSCs各相細胞分布圖Figure 6 Cell distribution of DPSCs in FD, D, HA and α-MEM groups

圖7 凍干牙本質活性生物材料(FD),未凍干牙本質(D),羥基磷灰石/磷酸三鈣(HA),蓋玻片(coverslip)對牙髓干細胞肌動蛋白免疫熒光強度及結構的影響 (scale bar=100 μm)Figure 7 Effects of freeze-dried dentin bioactive materials(FD), dentin(D), hydroxyapatite/tricalcium phosphate(HA) and coverslip on the immunofluorescence intensity and structure of actin in dental pulp stem cells (scale bar=100 μm)

骨與牙本質是人體內的主要硬組織,二者在細胞組成、組織結構、功能行使、組織來源上差異顯著。本研究中用于制備凍干牙本質的流程在凍干骨制備流程上經過改良,制備而成的凍干牙本質具有良好的撓曲強度及彈性模量,這對細胞層面的組織再生及宏觀層面的牙齒功能行使均有積極的作用。

材料的力學性能、構成、化學成分、與細胞接觸部分的結構特征等等因素均會影響細胞與材料的初步接觸、黏附及在材料表面及內部的生長[13]。本研究中各組材料與DPSCs相互作用的體外研究顯示:FD組與D組表面DPSCs細胞骨架結構更為清晰,骨架蛋白熒光強度高,細胞間交通明顯,表明牙本質的表面形態(tài)及儲藏的多種成牙相關蛋白能夠促進牙髓干細胞的生物學行為。細胞表面及內部存在大量感受外部環(huán)境的相關結構,細胞能夠根據捕獲的信息對材料做出進一步反應,即地形學(topographies)[14]。類似地,動力傳導(mechanotransduction)理論認為,生物體細胞所處環(huán)境中眾多因素,如材料結構、細胞受力情況等可經細胞內在處理后轉變?yōu)閮仍诘幕瘜W信息,這些化學信息將進一步影響細胞的增殖、分化及黏附等相關功能[15]。DPSCs在不同支架材料表面的長期生長分化模式可能與細胞和不同材料最初的接觸模式有關。有研究顯示牙髓干細胞-材料第一階段的相互作用(包括細胞接觸、黏附、伸展)會影響第二階段DPSCs向成牙本質細胞的分化[16]。

支架材料的結構及形態(tài)會影響接種或歸巢于其表面及內部的細胞行為。細胞外微環(huán)境同樣會對細胞次級結構產生作用,如細胞黏附分子受體、構成成分、遷移軌跡、超細胞特征等，即材料對細胞的“接觸誘導”。關于細胞與不同表面及內部結構的材料研究已相對深入,并建立多個有關“接觸誘導”的理論[17]。

例如研究將硅膠材料處理成具有小管狀的結構,在其上接種牙源性細胞,同時將牙源性細胞接種于光滑的硅膠材料表面,兩組細胞顯示出截然不同的膠原分泌能力及生物學行為:小管狀硅膠表面的牙源性細胞能夠進入小管,與生理情況更為相似[18]。

本研究撓曲強度檢測結果表明,結合EDTA脫礦處理的冷凍干燥牙本質基質制備技術能夠保持與天然牙本質相似的機械性能;組織學染色結果表明凍干處理前后牙本質的組織學結構未發(fā)生明顯改變;而良好的機械力學性能和適宜DPSCs生長的微結構均有利于提高組織工程牙再生的成功率。COL1釋放檢測結果及冷凍干燥原理提示FD保留了牙本質中的生物活性物質,而細胞在凍干前后兩組牙本質支架表面及在HA和玻片表面骨架蛋白形態(tài)的反差印證了材料結構和生物活性物質的保留對細胞產生的巨大影響。本研究研制的牙本質生物活性材料為組織工程牙再生提供具有應用前景的新型支架。另一方面,凍干技術使材料便于保存和運輸,為組織工程牙庫的建立提供支持,其制備成本使牙庫的日常商業(yè)應用成為可能,為牙組織工程的臨床轉化提供依據。