魏 明,甘 露,王雯智,于 瑋,魏 榮

(1西安醫(yī)學院藥理學教研室,西安 710021;2陜西省人民醫(yī)院婦科;3陜西省榆林市第二醫(yī)院;*通訊作者,E-mail:9790148@qq.com)

隨著社會的進步,女性的平均壽命逐步增加,老齡化的女性越來越多,絕經(jīng)后肥胖的發(fā)病率也日趨增加,絕經(jīng)后肥胖與胰島素抵抗和2型糖尿病密切相關,嚴重影響絕經(jīng)后婦女的健康。

小檗堿(berberine,Ber)是中草藥黃連的主要活性成分。研究發(fā)現(xiàn),Ber具有一系列藥理作用,如脂質調節(jié),抗炎和降血糖作用[1,2]。但目前小檗堿對去卵巢(OVX)模型小鼠肝臟脂代謝研究未見相關報道,因此本實驗采用OVX小鼠作為絕經(jīng)后動物模型,觀察小檗堿對去卵巢小鼠脂代謝的改善作用,并探討其作用機制,為小檗堿在絕經(jīng)后肥胖女性中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 去卵巢動物模型的建立

在空軍軍醫(yī)大學購買并培養(yǎng)30只健康的10周齡C57BL/6雌性小鼠,小鼠適應1周后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉,背部消毒,依次切開皮膚和皮下組織及腹膜,在輸卵管和子宮角的連接處結扎,移除卵巢。在sham組中,卵巢沒有被移除,只有部分腹部脂肪組織被移除。實驗期間小鼠的處置符合西安醫(yī)學院倫理委員會頒布的實驗動物倫理標準。

1.2 實驗分組情況及處理

將30只雌性C57BL/6小鼠隨機分成3組:sham組、OVX和OVX+小檗堿組。sham和OVX組每天用生理鹽水灌胃,而小檗堿治療組以小檗堿灌胃,以50 mg/kg的劑量給藥,治療時間為8周。實驗過程中,每2周稱取小鼠體質量,小鼠處死前眼球取血檢測血清甘油三酯和游離脂肪酸,處死后取肝臟稱重并計算肝臟指數(shù),取部分肝組織進行油紅O染色,部分用于Western-blot檢測。

1.3 小鼠體質量記錄

實驗過程中,每2周稱量小鼠體質量。

1.4 標本采集

最后一次給藥后稱重,禁食8 h,1%戊巴比妥鈉(0.15 ml/20 g)腹腔注射麻醉,眼球收集血液,分離血清,-20 ℃保存。取肝臟稱重,計算肝臟臟器指數(shù)=肝臟重量/小鼠體質量,部分組織-80 ℃保存,部分進行油紅O染色。

1.5 肝油紅O染色

油紅O是一種脂溶性染料,可特異性地染色組織中的TAG等中性脂肪。4%中性甲醛固定冰凍切片30 min,蒸餾水沖洗,60%異丙醇漂洗3 min,油紅O避光染色15 min,60%異丙醇溶液漂洗1 min,蒸餾水洗,蘇木素染核1 min,蒸餾水洗,封片。

1.6 比色法測定血清甘油三酯和游離脂肪酸

取血清7 μl,加入700 μl工作液,混合并置于37 ℃水浴中10 min,使用7 μl蒸餾水和標準溶液7 μl作為對照。與樣品平行操作,以空白管調零,用酶標儀于546 nm處比色測定各管吸光度值,與標準液比較計算樣品中甘油三酯含量。TG(mmol/L)=AT/AS×2.26。另測定血清游離脂肪酸使用游離脂肪酸檢測試劑盒,測定方法同上。

1.7 肝p-AMPK-α蛋白檢測

從肝組織中提取總蛋白,BCA法蛋白定量,配制12%分離膠和6%濃縮膠;點樣孔中加入50 μg蛋白樣品,加入電泳緩沖液,120 V 20 min后將電壓改成160 V 120 min;200 mA恒流轉膜2 h;NC膜麗春紅染色,并按各目的蛋白所在位置剪膜。1 ∶1 000兔抗小鼠p-AMPK-α孵育過夜,羊抗兔IgG二抗孵育1 h,化學發(fā)光成像,灰度分析,采用p-AMPK-α/β-actin表示蛋白相對表達量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結果

2.1 小鼠體質量

術后8周,OVX小鼠的體質量顯著高于sham組小鼠(P<0.05)。但小檗堿治療8周后能顯著減少OVX小鼠的體質量(P<0.05,見圖1)。

與sham組比較,#P<0.05;與OVX組比較,*P<0.05圖1 各組小鼠體質量的變化 (n=10)Figure 1 Changes of weight of mice in each group (n=10)

2.2 小鼠肝臟指數(shù)

與sham組小鼠相比,OVX組小鼠肝臟指數(shù)明顯升高(P<0.05);與OVX組相比,小檗堿處理后小鼠的肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05,見圖2)。

與sham組比較,#P<0.05;與OVX組比較,*P<0.05圖2 各組小鼠肝臟指數(shù)統(tǒng)計圖 (n=10)Figure 2 Comparison of liver index among three groups (n=10)

2.3 肝組織油紅O染色

8周后,與sham組相比,OVX小鼠肝組織中出現(xiàn)更多的脂滴,OVX小鼠小檗堿處理后,肝組織中的脂滴顯著減少(見圖3)。

2.4 各組脂代謝指標的比較

與sham組相比,OVX組血清甘油三酯和游離脂肪酸顯著增加(P<0.05);與OVX組小鼠比較,小檗堿治療后,小鼠血清甘油三酯和游離脂肪酸較OVX明顯降低(P<0.05,見圖4)。

圖3 小檗堿改善OVX小鼠肝脂質積累 (標尺=50 μm)Figure 3 Berberine improves liver lipid accumulation in OVX mice (bar=50 μm)

與sham組比較,#P<0.05;與OVX組比較,*P<0.05圖4 小檗堿改善OVX小鼠脂代謝 (n=10)Figure 4 Berberine improves lipid metabolism in OVX mice (n=10)

2.5 p-AMPK-α蛋白的表達

與sham組相比,OVX組小鼠肝臟p-AMPK-α蛋白表達明顯減少(P<0.01);與OVX組相比,小檗堿組p-AMPK-α蛋白明顯增加(P<0.01,見圖5)。

3 討論

絕經(jīng)后雌激素的缺乏通常伴隨著體質量的增加[3]。研究表明,卵巢功能的降低可以增加代謝綜合征的發(fā)病率[4]。本實驗的結果顯示,卵巢切除小鼠的體質量增加顯著高于假手術組,卵巢切除小鼠肝臟質量也明顯高于假手術組。其原理可能是卵巢切除術后,雌激素大大減少,血液LDL、總膽固醇升高,肝細胞脂滴積聚,肝臟脂質增加,肝臟質量增加。

與絕經(jīng)前婦女相比,絕經(jīng)后婦女在腹部聚集了大量脂肪。因此,與肥胖相關的疾病,如糖尿病、冠心病等代謝性疾病在絕經(jīng)后發(fā)病明顯上升[3]。

圖5 各組小鼠肝臟p-AMPK-α蛋白的表達Figure 5 Expression of p-AMPK-α protein in liver in each group

OVX小鼠模擬了人類絕經(jīng)和雌激素缺乏,以及導致肥胖及相關的綜合征,包括脂肪炎癥、高血糖及脂肪肝[5]。我們的結果與之前的研究一致[5]。與sham組相比,OVX組血清甘油三酯和游離脂肪酸顯著升高。紅油染色提示肝臟中脂滴明顯增加,并出現(xiàn)脂肪肝。通過小檗堿治療后,OVX小鼠血甘油三酯及游離脂肪酸明顯下降,肝臟切片油紅O染色脂肪滴明顯減少。研究報道小檗堿能減輕高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝臟脂肪變性和氧化應激損傷,其作用機制可能是通過上調SIRT1蛋白的表達,從而抑制p53的乙?；痆6]。但是沒有文獻報道小檗堿對絕經(jīng)后肥胖以及脂肪肝的治療作用。

脂肪細胞肥大和炎癥導致脂肪細胞功能障礙,導致肥胖和相關疾病,如胰島素抵抗、2型糖尿病和脂肪肝[7]。OVX組循環(huán)中甘油三酯增加,誘導脂肪滴積聚,但小檗堿治療后改善血脂異常以及肝臟甘油三酯積聚,使內臟脂肪的慢性炎癥環(huán)境減輕,促進內臟脂肪的分解,并抑制內臟脂肪的合成。

AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)是脂代謝的關鍵調控者,AMPK最具有特征性靶點是在肝臟和下丘腦的脂肪酸合成通路。AMPK磷酸化的激活可以通過降低脂肪酸合成酶的表達來減少脂肪酸的產(chǎn)生[8-10]。在本實驗中,OVX組小鼠肝臟p-AMPK-α蛋白表達明顯減少,小檗堿給藥8周后,OVX小鼠肝臟p-AMPK-α蛋白明顯增加。這表明小檗堿可能通過激活p-AMPK-α來改善OVX小鼠肝臟的脂肪代謝。

在模擬女性絕經(jīng)的OVX小鼠模型中,小檗堿能夠抑制OVX小鼠肥胖,同時改善OVX小鼠肝臟脂代謝。這些結果表明,小檗堿可能有益于絕經(jīng)后肥胖及脂代謝紊亂的治療,需進一步研究為絕經(jīng)后肥胖患者提供用藥選擇。