甄亞男,甄 誠,葛賢明,郭 濱,魏 芳,韋穎梅,劉 浩

(蚌埠醫(yī)學院藥學院安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:liuhao6886@foxmail.com;#共同通訊作者,E-mail:bbmcwym@163.com)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性、進行性、多發(fā)性、侵襲性的,并以關(guān)節(jié)滑膜炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的自身免疫性疾病[1,2]。大量研究表明,成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)在RA中異?；罨?是RA滑膜病理過程中的關(guān)鍵參與者[3-5]。因此,通過抑制類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞增殖、侵襲和遷移能力,可有效控制滑膜炎癥,保護關(guān)節(jié)軟骨和骨。

研究表明,在富含氧自由基、NO和細胞因子的微環(huán)境中,RA-FLS表現(xiàn)出多種腫瘤細胞樣特征[6]。尤其糖代謝在RA發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用,多種與糖代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶在RA中表達增高[7,8],并且對葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1、單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白和6-磷酸果糖-2激酶的抑制,或丙酮酸脫氫酶的激活,均顯示出可抑制RA-FLS的增殖,改善小鼠炎癥性關(guān)節(jié)炎[6,9-12]。在RA-FLS中發(fā)現(xiàn)的代謝變化可能是風濕性疾病發(fā)病的新機制,而以代謝功能障礙為靶點可能為RA提供新的治療途徑。

BAY-876是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)抑制劑,競爭性抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的反應,限制了后續(xù)進行的糖代謝等過程,減少ATP的產(chǎn)生,促使細胞死亡[13]。本研究旨在觀察GLUT1抑制劑BAY-876對類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞增殖、遷移及侵襲的作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國Gibco公司,胎牛血清購自浙江天杭生物科技公司BAY-876購于美國Selleck公司,兔抗人MMP-2、MMP-9、AKT抗體、鼠抗人β-actin抗體購于英國Abcam,CCK-8、ATP檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細胞株及細胞培養(yǎng)

類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞(RA-FLS)購自BeNa Culture Collection(BNCC),凍存培養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學院生化藥理實驗室。人類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中(青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L),置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖的抑制作用

取對數(shù)生長期的RA-FLS細胞接種于96孔板中,7 000個/孔。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,加入梯度濃度BAY-876處理細胞,同時設調(diào)零孔和空白培養(yǎng)基對照組,BAY-876的藥物濃度為0.5,1,2,4,8 μmol/L,每組設5個復孔。藥物處理培養(yǎng)24,48,72 h后,每孔加入10 μl CCK-8,37 ℃烘箱孵育1 h。肉眼觀察細胞孔中顏色由黃色變成深橙色,于酶標儀中讀取波長450 nm處的吸光度值(optical density,OD)。以上實驗重復3次。計算細胞的存活率:細胞存活率(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.4 細胞內(nèi)ATP水平的檢測

取對數(shù)生長期的RA-FLS細胞種于6孔板中,2.5×105個/孔,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,分為4組,加入含有不同濃度(0,2,4,8 μmol/L)BAY-876的培養(yǎng)液處理4 h,加入適量ATP裂解液收集細胞并轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min取上清用于后續(xù)分析。使用ATP測定試劑盒(碧云天)進行檢測。實驗重復3次。

1.5 細胞劃痕實驗

六孔板背面垂直于橫軸、每隔0.5-1.0 cm用記號筆劃線。取對數(shù)生長期RA FLS細胞接種于6孔板中,5×105個/孔。待生長至90%融合時,用200 μl槍頭垂直于板面,沿標記線劃痕。用PBS洗兩次,洗去劃下的漂浮細胞。加入含有不同濃度(2,4,8 μmol/L)BAY-876的無血清培養(yǎng)基,置于5% CO2,37 ℃,飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。同時設置空白對照組(0 μmol/L BAY-876,即不含藥物培養(yǎng)基組),每組均設3個復孔,實驗重復3次。加入不含血清培養(yǎng)基后,在0 h和18 h分別于倒置顯微鏡下拍照觀察。計算細胞遷移率:細胞遷移率=(0 h劃痕面積-培養(yǎng)18 h后劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.6 Transwell侵襲實驗

將Materigel膠與預冷的無血清DMEM培養(yǎng)基按1 ∶8的比例稀釋,用預冷的200 μl槍頭以每孔60 μl均勻包被Transwell小室底部膜的內(nèi)表面,放入細胞培養(yǎng)箱30 min以上使之成膠。取對數(shù)生長期的RA-FLS細胞,經(jīng)消化離心后,用無血清培養(yǎng)基進行重懸計數(shù),每個內(nèi)室內(nèi)加入200 μl藥物濃度分別為0,2,4,8 μmol/L的細胞懸液,除陰性對照組外每孔均含5×105個細胞。于24孔板即外室中加入800 μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。加入后1 h內(nèi)每10 min觀察一次下室避免有氣泡產(chǎn)生。該實驗分為空白對照組(0 μmol/L BAY-876,即不含藥物培養(yǎng)基組)、不同濃度BAY-876(2,4,8 μmol/L)組,每組均設三個復孔。于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)48 h;取出小室,PBS清洗兩次,4%多聚甲醛固定15 min;用PBS濕潤的棉簽輕輕擦去上室表面未侵襲的細胞,用1%結(jié)晶紫染液室溫下染色10 min;PBS漂去多余染料,顯微鏡下每孔隨機取5個視野拍照,計數(shù)并求平均值。

侵襲抑制百分率(%)=(1-實驗組細胞侵襲數(shù)/空白對照組細胞侵襲數(shù))×100%。

1.7 Transwell遷移實驗

除無需鋪基質(zhì)膠外,其余處理步驟同1.6中所述內(nèi)容,所有實驗重復三次。

遷移抑制百分率(%)=(1-實驗組細胞遷移數(shù)/空白對照組細胞遷移數(shù))×100%。

1.8 Western blot檢測MMP-2、MMP-9及AKT蛋白的表達

將細胞接種于60 mm平皿48 h后,收集細胞,加入適量的蛋白裂解液,冰上裂解30 min。4 ℃低溫離心機12 000 r/mim離心30 min,提取蛋白上清,使用BCA法進行蛋白定量,使各組蛋白至等濃度。每組取40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳;轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜;用5%脫脂牛奶封閉4 h;PBST溶液洗膜3次,5 min/次;4 ℃一抗過夜,PBST溶液洗膜3次;二抗室溫下孵育2 h;PBST溶液洗膜3次,5 min/次;ECL試劑盒暗室發(fā)光顯影,Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.9 統(tǒng)計分析方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,多組比較采用單因素方差分析及兩因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BAY-876對RA FLS的増殖抑制作用

分別用0，0.5,1,2,4,8 μmol/L的BAY-876處理細胞,然后CCK-8法檢測24,48,72 h細胞增殖情況,結(jié)果顯示,各濃度組BAY-876的抑制率明顯高于對照組,與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且對RA-FLS增殖的抑制作用呈劑量依賴性,并隨著處理時間延長,細胞存活率下降(見圖1)。

與0 μmol/L BAY-876比較,*P<0.05圖1 BAY-876對RA FLS細胞存活率的影響Figure 1 Effects of BAY-876 on the viability of RA FLS cells

2.2 BAY-876對RA FLS細胞中ATP水平的影響

與對照組比較,2,4,8 μmol/L BAY-876作用4 h均可明顯降低RA FLS細胞內(nèi)的ATP水平(P<0.01),并隨著BAY-876濃度增加,RA FLS細胞內(nèi)的ATP水平顯著降低,與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖2)。

與0 μmol/L BAY-876(對照)比較,**P<0.01圖2 BAY-876對RA FLS細胞內(nèi)ATP水平的影響Figure 2 The intracellular ATP level of RA FLS cells after treated with BAY-876

2.3 細胞劃痕實驗

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示:2,4,8 μmol/L BAY-876處理組均可抑制RS FLS細胞的劃痕愈合速度,而隨著劑量增加,與對照組相比,8 μmol/L組明顯抑制了劃痕的愈合(見圖3),與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

與0 μmol/L BAY-876(對照)比較,**P<0.01圖3 劃痕實驗檢測BAY-876對RA-FLS細胞遷移能力的影響 (×40)Figure 3 Effect of BAY-876 on the migration of RA-FLS by Transwell assay (×40)

2.4 BAY-876對RA FLS遷移和侵襲能力的影響

Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,2,4,8 μmol/L BAY-876作用于RA FLS細胞遷移抑制率分別為(16.2±3.9)%、(60.1±3.0)%和(68.2±2.3)%,侵襲抑制率分別為(62.6±3.3)%、(85.3±3.7)%和(91.8±3.2)%,與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖4)。表明BAY-876可以抑制RA FLS細胞遷移和侵襲活性。

2.5 Western blot檢測MMP-2、MMP-9及AKT的表達

Western blot結(jié)果表明,2、4、8 μmol/L BAY-876作用于RA FLS細胞48 h,MMP-2、MMP-9及AKT蛋白的表達明顯下降(見圖5)。

3 討論

正常細胞主要利用氧化磷酸化獲取能量維持細胞的正常生長,而糖酵解上調(diào)的細胞群和耐酸性細胞群具有強大的生長優(yōu)勢,可以促進細胞的增殖侵襲。炎癥關(guān)節(jié)微環(huán)境的特征是缺氧和低濃度的營養(yǎng)物質(zhì)[10],與腫瘤的微環(huán)境有相似的特征。而GLUT1本身作為葡萄糖轉(zhuǎn)運的一個限速因素,其功能缺失會導致葡萄糖吸收障礙,降低細胞內(nèi)ATP水平,從而抑制RA-FLS的增殖[14]。BAY-876能特異性抑制糖代謝過程的限速酶GLUT1的活性,使細胞因ATP供應不足而死亡[15]。文獻表明BAY-876在食道癌[16],卵巢癌[17]治療中有較好的抗腫瘤作用。并且在CCK-8實驗中明確BAY-876對RA-FLS細胞存活率的影響具有時間和濃度依賴性。通過調(diào)控AKT信號通路可降低糖酵解中GLUT1和己糖激酶2的表達,從而抑制滑膜細胞對葡萄糖的吸收和糖酵解過程,也就是說AKT信號通路與滑膜細胞凋亡異常密切相關(guān),異常激活此信號通路是滑膜細胞凋亡失衡的機制之一[18,19]。

與0 μmol/L BAY-876比較,**P<0.01圖4 Transwell小室法檢測BAY-876對RA-FLS細胞遷移和侵襲能力的影響Figure 4 Effect of BAY-876 on migration and invasion of RA-FLS by Transwell

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一組Zn2+、Ca2+依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶家族,可由成纖維細胞、中性粒細胞、巨噬細胞及腫瘤細胞合成和分泌,降解ECM[20]。通過抑制分泌活化表達MMPs的細胞及與其作用機制相關(guān)的酶類和途徑,可能下調(diào)MMPs表達并降低其活性,從而抑制RA-FLS的侵襲轉(zhuǎn)移[21]。研究顯示MMP-2和MMP-9富有侵襲性偽足,有助于體內(nèi)外細胞外基質(zhì)降解[22]。

AKT信號通路是重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路,細胞的運動以及血管的發(fā)生與AKT信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān),重要的是AKT信號轉(zhuǎn)導通路還可上調(diào)MMP-2蛋白質(zhì)的表達,MMP-2降解細胞外基質(zhì),促進細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[23]。而通過劃痕實驗和Transwell實驗進一步證實BAY-876對RA-FLS的侵襲遷移能力有抑制作用,并且隨著濃度的增加,BAY-876對RA-FLS的抑制作用增強。Western blot的結(jié)果表明,BAY-876下調(diào)MMP-2、MMP-9和AKT蛋白的表達,其機制可能通過AKT通路調(diào)控MMP-2和MMP-9來抑制RA FLS的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述,本研究證明了BAY-876可抑制類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞的增殖及轉(zhuǎn)移能力,其機制可能是通過抑制AKT信號通路下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達,但其具體的分子機制有待于進一步研究。