李忠偉，張樹文，賀 苗，陸 帥，郭財進，陳 曦

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院，2護理學(xué)院，烏魯木齊 830011)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)具有致殘率高、后期康復(fù)及生活負擔(dān)重等特點，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stem cells，BMSCs)作為種子細胞定向移植可促進SCI修復(fù)及功能恢復(fù)已得到廣泛的證實[1]。但是，BMSCs定向移植后因細胞生長環(huán)境改變、脊髓原發(fā)性損傷炎性反應(yīng)以及脊髓損傷后相關(guān)抑制性信號通路開放所致繼發(fā)性損傷導(dǎo)致移植細胞出現(xiàn)凋亡、生長緩慢、分化抑制等難題[2-3]。相關(guān)文獻認為繼發(fā)性損傷所導(dǎo)致的病理生理變化對神經(jīng)功能恢復(fù)起決定性作用，而相關(guān)抑制性信號通路開放所致趨化因子和細胞因子的活化正是SCI后招募、激活炎性細胞的扳機點，從而進一步加重SCI的繼發(fā)性損傷[4-5]。細胞移植后生長環(huán)境改變、脊髓原發(fā)性損傷炎性反應(yīng)難以避免，脊髓損傷可致使Ras同源基因/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶(Rho/Rock)、Notch等多條信號通路的激活，這些以Rho/Rock為終末的信號通路均可激活炎性因子、加速細胞凋亡、抑制軸突再生從而抑制脊髓損傷的修復(fù)及神經(jīng)功能的恢復(fù)[6]。因此，本研究將Rho/Rock信號通路阻斷劑應(yīng)用于SCI大鼠治療當(dāng)中，旨在探討阻斷Rho/Rock信號通路聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植于脊髓損傷大鼠后對其神經(jīng)功能修復(fù)的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組選取5只周齡為3～4周、體質(zhì)量為100 g健康雄性SD大鼠用于BMSCs的提取，選取80只周齡為8周、體質(zhì)量300 g雄性SD大鼠用于制作模型。SD大鼠均為清潔級，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)中心提供，本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(編號：IACUC20161208-05)。將80只大鼠根據(jù)不同實驗干預(yù)措施隨機分為SCI模型組、BMSCs移植組、Fasdiual治療組、聯(lián)合治療組(20只/組)。

1.2 試劑及儀器設(shè)備胎牛血清、低糖DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、雙抗、0.5%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；神經(jīng)元性特異性烯醇化酶(NSE)抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體及四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)標記的羊抗兔IgG抗體、二脒基苯基吲哚(DAPI)復(fù)染液(武漢博士德公司)，神經(jīng)絲蛋白(NF200)抗體(北京博奧森公司)。超凈工作臺(蘇凈安泰)，高速離心機(美國Thermo公司)倒置相差顯微鏡(Carl Zeiss)，恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Hera Cell)，圖像采集設(shè)備(fecia DM3000)。

1.3BMSCs的提取、培養(yǎng)、純化及鑒定無菌條件下取出5只周齡3～4周、體質(zhì)量為100 g大鼠的雙側(cè)股骨及脛骨，置于5%雙抗的DMEM中，用低糖DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔，反復(fù)吹打成單細胞懸液，清洗、離心細胞2次去除肉眼可見的雜質(zhì)及油脂。用含體積分數(shù)12%胎牛血清的DMEM制作單細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h首次換液棄去未貼壁的懸浮細胞，之后每3天換一次液，當(dāng)細胞生長至80%～ 90%時，進行胰酶消化傳代(1∶3傳代)，第3代細胞已經(jīng)去除非貼壁的骨髓造血干細胞，得到純化的BMSCs，使用流式細胞計數(shù)進行檢測。移植前用毛細吸管反復(fù)吹打分離細胞，制作單細胞懸液，PBS洗滌2次，調(diào)整細胞密度為1×106個/μL，移植備用。

1.4 SCI大鼠模型制作取SD大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg)后，麻醉生效后固定于解剖板上備皮消毒，以胸10為中心做5 cm長切口，逐層分離暴露胸9、10、11棘突和椎板，咬除棘突及椎板充分暴露脊髓。根據(jù)改良Allen法用5 g砝碼從16 cm高度通過適當(dāng)粗細的玻璃試管自由下落，砝碼柄端朝下，打擊面積約3.0 mm2。砝碼自由落下打擊到脊髓時大鼠迅速出現(xiàn)雙下肢回縮撲動及擺尾動作，隨后出現(xiàn)遲緩性癱瘓，迅速移除砝碼后可見脊髓充血水腫，提示SCI模型制作成功，生理鹽水沖洗后逐層關(guān)閉切口。術(shù)后膀胱按摩3～5次/d，促進反射性排尿至恢復(fù)正常排尿，20萬U/kg青霉素皮下注射3～5 d預(yù)防切口及泌尿系感染。

1.5 干預(yù)方法SCI模型組：脊髓損傷模型制作成功后逐層關(guān)閉切口，30 min后腹腔注射1 mL的0.9%氯化鈉注射液。BMSCs移植組：脊髓損傷模型制作成功后30 min腹腔注射1 mL的0.9%氯化鈉注射液，術(shù)后5 d沿原切口切開暴露脊髓損傷節(jié)段，硬膜下注射10 μL的1×106/μL骨髓間充質(zhì)干細胞單細胞懸液。Fasdiual治療組：脊髓損傷模型制作成功后30 min腹腔注射1 mL的Fasdiual (0.85 mg/kg)，術(shù)后5 d沿原切口切開暴露脊髓損傷節(jié)段，硬膜下注射10 μL 0.9%氯化鈉注射液。聯(lián)合治療組：脊髓損傷模型制作成功后30 min腹腔注射1 mL Fasdiual (0.85 mg/kg )，術(shù)后5 d天沿原切口切開暴露脊髓損傷節(jié)段，硬膜下注射10 μL 1×106個/μL骨髓間充質(zhì)干細胞單細胞懸液。

1.6 運動功能評分由本課題組2名研究人員采用BBB(basso-beattie-bresnahan)評分法分別于SCI術(shù)后第1、7、14、21、28天同一時間段對各組大鼠后肢運動功能進行評分，評分范圍0～21分，0分為無后肢運動，21分為后肢正常運動，評分取平均值。

1.7 組織學(xué)觀察SCI術(shù)后第28天各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛，麻醉處死各組SCI大鼠，按原切口進入，以損傷脊髓節(jié)段為中心切取約1 cm長度完整脊髓組織，置于4%多聚甲醛固定48 h，常規(guī)梯度脫水、石蠟包埋。取蠟塊制片，厚度4 μm，60℃烤箱烤片過夜備用。切片經(jīng)脫蠟、脫水、透明后分別進行HE、免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色，鏡下觀察脊髓標本形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)以及NSE、NF200、GFAP的表達。

1.8 免疫組織化學(xué)半定量分析采用Image-Rro-Plus圖像分析軟件對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進行分析，根據(jù)陽性染色細胞及染色強度計算出光密度值，用于后續(xù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)及鑒定初次換液后原代細胞呈集落分布于培養(yǎng)瓶，經(jīng)傳代后均勻生長，3代細胞均勻分布，細胞呈梭形。3代細胞表型CD29、CD45的陽性率分別為82.4%、2.0%，見圖1。

2.2 BBB評分各組SCI大鼠術(shù)后1 d評分均位于較低水平，運動范圍為無運動到1～2個關(guān)節(jié)的輕微運動，術(shù)后1～28 d各組SCI大鼠運動功能均有改善，以術(shù)后14～28 d改善幅度相對較大，以聯(lián)合治療組運動改善效果最佳，聯(lián)合治療組在損傷第14天開始SCI大鼠BBB評分逐漸優(yōu)于其余治療組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3 HE染色SCI術(shù)后第28天觀察各組標本HE結(jié)果顯示聯(lián)合治療組脊髓傷修復(fù)效果明顯，脊髓空洞面積最小，其次為BMSCs移植組和Fasdiual治療組，而SCI模型組空洞面積最大，損傷組織的修復(fù)效果較差，見圖2。BMSCs移植組、Fasdiual治療組和聯(lián)合治療組分別與SCI模型組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

圖1 3代BMSCs細胞的鑒定結(jié)果

表1 SCI大鼠術(shù)后不同時間點BBB評分(分，±s，n=20)

注：與SCI模型組比較，*P<0.05; 與BMSCs移植組比較，▲P<0.05； 與Fsadiual治療組比較，△P<0.05。

圖2 SCI標本28 d時HE染色觀察(×200)

表2 SCI大鼠術(shù)后28 d脊髓空洞面積比較(mm ±s，n=20)

注：與SCI模型組比較，*P<0.05； 與BMSCs移植組比較，▲P<0.05； 與Fsadiual治療組比較，△P<0.05。

2.4 免疫組織化學(xué)染色免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示NSE、NF200、GFAP在各組均有陽性表達。半定量分析結(jié)果顯示NF200、NSE在聯(lián)合治療組陽性表達顯著高于其他各組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。BMSCs移植組和Fasdiual治療組的NSE、NF200的陽性表達分別與SCI模型組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；GFAP以聯(lián)合治療組陽性表達最少，與其他各組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，其次為BMSCs治療組和Fasdiual治療組，分別與陽性表達最高的SCI模型組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。半定量分析見表3。

2.5 免疫熒光染色免疫熒光染色結(jié)果顯示免疫熒光染色可見神經(jīng)特異性標志物NF200、NSE、GFAP在各組均有陽性表達。NF200、NSE在各組細胞胞質(zhì)周圍呈紅色熒光，并且在SCI模型組、BMSCs移植組、Fasdiual治療組和聯(lián)合治療組中熒光密度逐漸增強；GFAP熒光呈放射狀分布，在SCI模型組、BMSCs移植組、Fasdiual治療組和聯(lián)合治療組中熒光密度逐漸減弱。本研究均未發(fā)現(xiàn)NF200、NSE、GFAP在各組熒光強度有顯著性變化，見圖4。

圖3 SCI標本28 d免疫組織化學(xué)染色觀察(×400)

注：NSE分布于脊髓灰質(zhì)區(qū)，各組脊髓灰質(zhì)區(qū)損傷程度與脊髓背側(cè)打擊區(qū)均較輕，NF200、GFAP在脊髓區(qū)域均有分布；SCI模型組脊髓打擊區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，損傷區(qū)空洞形成，BMSCs移植組、Fasdiual治療組較SCI模型結(jié)構(gòu)紊亂及空泡變性程度較輕，兩組無明顯差異，聯(lián)合治療組較前3組相比病理結(jié)構(gòu)明顯減輕，仍有少量空泡變性。

表3 各組大鼠脊髓組織各蛋白表達的半定量值分析

注：與SCI模型組比較，*P<0.05； 與BMSCs移植組比較，▲P<0.05； 與Fsadiual治療組比較，△P<0.05。

3 討論

脊髓損傷(SCI)由初始的原發(fā)性和漸進的繼發(fā)性兩部分損傷共同所致[7]。目前，因各種外傷因素造成脊髓結(jié)構(gòu)破壞的原發(fā)性損傷還無法可控，僅限于手術(shù)解除壓迫為脊髓恢復(fù)創(chuàng)造有利條件；然而，以脊髓水腫、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細胞凋亡、神經(jīng)元不能再生一系列聯(lián)動的繼發(fā)性損傷是可以干預(yù)的，也是當(dāng)前解決脊髓損傷再生修復(fù)的研究方向[7]。脊髓損傷后軸突再生和正確靶向是損傷后脊髓修復(fù)與功能重建的難點，干細胞移植治療脊髓損傷能很好解決這一難題，其中的BMSCs定向分化移植是最具應(yīng)用前景之一[1,8]。但由于BMSCs移植于損傷脊髓后會繼發(fā)性損傷出現(xiàn)移植細胞生存率下降、生長緩慢、定向分化抑制等不利的方面。所以，本課題以此為據(jù)點進行研究。

相關(guān)文獻認為脊髓損傷后相關(guān)抑制信號通路開放所致繼發(fā)性損傷所導(dǎo)致的病理生理改變是神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵因素[6]。脊髓損傷后可抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)信號通路、Notch信號通路、Ras同源基因/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶(Rho/Rock)信號通路等多條信號通路，它們均能激活的Rho來傳導(dǎo)抑制信號[9]，再激活下游效應(yīng)因子Rho相關(guān)蛋白激酶Rock，影響細胞內(nèi)變化并導(dǎo)致再生軸突的生長錐塌陷及神經(jīng)突觸回縮，各種分子機制調(diào)控使 Rho在實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中承擔(dān)著“分子開關(guān)”的作用。因此，通過抑制脊髓損傷后再生抑制信號通路的關(guān)鍵匯聚點Rho/Rock信號通路對脊髓損傷修復(fù)至關(guān)重要[10]。因此，本研究將阻斷Rho/Rock信號通路與骨髓間充質(zhì)干細胞移植相結(jié)合應(yīng)用于SCI大鼠治療中，旨在觀察兩者聯(lián)合后對脊髓損傷大鼠是否能更好地實現(xiàn)神經(jīng)功能的修復(fù)。

圖4 SCI標本28 d免疫熒光染色觀察(×200)

注：NF200、NSE在各組細胞胞質(zhì)周圍呈紅色熒光，GFAP熒光呈放射狀分布；免疫熒光結(jié)果顯示各組熒光強度無顯著性變化趨勢。

本研究顯示，脊髓損傷模型制備成功后，各組大鼠BBB評分均較低，隨著觀察時間的延長，脊髓修復(fù)及神經(jīng)功能恢復(fù)可有一定程度的改善，與其他脊髓半切實驗不同，本研究采用本課題組前期實驗改良Allen重物打擊法進行模型制備，此方法簡單，可操作性強，研究采用5 g 砝碼、16 cm 高度自由落體打擊，屬于重度損傷組[11]。SCI時大鼠可以看到很明顯的雙后肢抽動及擺尾動作，隨后出現(xiàn)雙后肢癱瘓狀態(tài)，麻醉蘇醒后呈雙后肢拖動行走，針刺反應(yīng)可出現(xiàn)雙后肢的輕微收縮，同時伴有尿潴留，屬于一種不完全性損傷，為后期脊髓修復(fù)及神經(jīng)功能恢復(fù)提供了可能性。楊新明等[12]探討丙戊酸(VPA)聯(lián)合BMSCs促進大鼠急性脊髓損傷，聯(lián)合治療組SCI術(shù)后14 d BBB評分為(9.76±0.95)分，結(jié)果明顯優(yōu)于VPA、BMSCs單獨治療組及SCI模型組。本研究通過BBB運動功能評分觀察發(fā)現(xiàn)，SCI大鼠脊髓損傷后第1、7天各組BBB評分均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，脊髓損傷干預(yù)后第14～28天，BBB評分逐漸出現(xiàn)差異性變化，并且干預(yù)組優(yōu)于SCI模型組，說明BMCSs移植組和Fasdiual均能促進SCI大鼠后肢功能的恢復(fù)，聯(lián)合治療可以更進一步加強后肢運動及神經(jīng)功能的恢復(fù)。

NF200、NSE作為反映神經(jīng)干樣細胞的特異性標志物蛋白，可反應(yīng)脊髓組織中神經(jīng)干樣細胞的表達量，對維護神經(jīng)細胞的功能及神經(jīng)組織的損傷修復(fù)發(fā)揮重要作用；這兩種蛋白是髓鞘的軸突中含量最多的蛋白，同時也對維持神經(jīng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和軸漿運輸以及與損傷神經(jīng)的修復(fù)具有極其重要的意義。脊髓損傷后由于各種不利因素導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)細胞變形壞死、結(jié)構(gòu)破壞及細胞崩解，失去其原有的功能，但損傷區(qū)周圍的細胞可通過合成這兩種蛋白來修復(fù)受損的神經(jīng)細胞[13]。GFAP是星形膠質(zhì)細胞的特異性標記物，在缺氧缺血后的反應(yīng)性膠質(zhì)細胞中明顯表達，同時也能反映中樞受損后的嚴重程度，也間接地反映受損區(qū)域無菌性炎性改變，促進炎性物質(zhì)產(chǎn)生從而抑制神經(jīng)功能的恢復(fù)[14]。本研究觀察結(jié)果顯示NF200和GFAP在整體脊髓中均有表達，而NSE在脊髓灰質(zhì)中的表達明顯。本研究從BMSCs移植組和Fasdiual治療組脊髓組織切片免疫組化及免疫熒光染色結(jié)果中發(fā)現(xiàn)NSE、NF200陽性表達均高于SCI模型組，提示BMSCs移植和阻斷Rho/Rock信號通路均可促進神經(jīng)細胞特異性標志蛋白的表達；BMSCs移植組和Fasdiual治療組中的GFAP陽性表達低于SCI模型組，研究結(jié)果顯示BMSCs移植后可減少局部組織中GFAP陽性表達，表明BMSCs可抑制星形膠質(zhì)細胞，可反映出其調(diào)節(jié)炎癥機制促進SCI大鼠的脊髓修復(fù)，這是BMSCs移植治療SCI大鼠的一個重要機制，其主要通過上調(diào)抗炎因子及下調(diào)趨化因子來實現(xiàn)對炎癥反應(yīng)的主導(dǎo)調(diào)節(jié)作用[15]；同時結(jié)果顯示，阻斷Rho/Rock信號通路使得GFAP陽性表達降低，減少局部損傷區(qū)炎癥反應(yīng)，從而達到減少脊髓的繼發(fā)性損傷的目的，為BMSCs移植正向修復(fù)提供了保障；聯(lián)合治療組的NSE、NF200的陽性表達均高于其他各組，而GFAP表達反之，這一研究結(jié)果提示兩種治療方式聯(lián)合能夠起到促進脊髓修復(fù)的協(xié)同作用。

從本研究結(jié)果得出，各治療組療效優(yōu)于SCI模型組，其中以聯(lián)合組療效最為顯著，表明BMSCs移植與Rho/Rock信號通路阻斷劑均可促進脊髓修復(fù)及神經(jīng)功能的恢復(fù)，且BMSCs移植聯(lián)合Rho/Rock信號通路阻斷劑具有更好的療效，兩者之間存在一定的協(xié)同效應(yīng)。結(jié)合相關(guān)文獻分析BMSCs移植在局部分化為神經(jīng)干樣細胞后分泌抗炎因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子等改善脊髓受損區(qū)域的微環(huán)境，促進微血管生成、減少細胞凋亡、促進軸突生長，對局部損傷區(qū)域起到神經(jīng)營養(yǎng)及保護的作用[8,16-17]，從而減少脊髓的繼發(fā)性損傷，加快損傷區(qū)域的脊髓修復(fù)。既往相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)干細胞聯(lián)合應(yīng)用能取得較好的療效，曾志謀等[18]研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合促紅細胞生成素治療大鼠脊髓損傷取得較好的療效，認為聯(lián)合治療可減少脊髓的出血、水腫，減輕炎性反應(yīng)；鄭竑等[19]研究干細胞靶向移植聯(lián)合促紅細胞生成素亦能改善SCI大鼠的預(yù)后。結(jié)合張小寧等[20]，董春磊等[21]研究，分別通過BMSCs向神經(jīng)干樣細胞誘導(dǎo)分化后移植以及BMSCs聯(lián)合減重步行訓(xùn)練觀察SCI療效，均得出神經(jīng)干樣細胞是促進神經(jīng)功能恢復(fù)的主要原因，因此推斷本研究中BMSCs向神經(jīng)干樣細胞的誘導(dǎo)分化可能是促進神經(jīng)修復(fù)的重要機制之一。相關(guān)研究證實通過阻斷Rho/Rock信號通路可促進BMSCs軸突導(dǎo)向及樹突棘形態(tài)發(fā)生，促進細胞軸突和樹突生長，同時Rho/Rock通路在CNS炎癥調(diào)控中也發(fā)揮著不可忽視的作用，抑制Rock能減少白細胞向脊髓的滲透，因此，控制炎癥也可能是抑制Rho/Rock信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮脊髓保護作用的重要機制之一。因此，本研究認為聯(lián)合治療可以維持受損脊髓節(jié)段神經(jīng)干樣細胞的生理功能，可能的機制是減少了受損脊髓節(jié)段神經(jīng)干樣細胞的死亡及維持原有的生存狀態(tài)和功能，或是抑制Rho/Rock信號通路可促進移植的BMSCs向神經(jīng)干樣細胞的定向分化，但是具體機制還需進一步深入研究。

綜上，本研究通過阻斷Rho/Rock信號通路和BMSCs移植均可促進SCI大鼠神經(jīng)功能的修復(fù)，且兩者聯(lián)合應(yīng)用促進脊髓修復(fù)方面上有協(xié)同作用，能更加有效地促進SCI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。但仍需進一步實驗探索Rho/Rock信號通路和BMSCs聯(lián)合治療促進SCI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的協(xié)同機制，以此為脊髓損傷的基礎(chǔ)治療提供一定的理論依據(jù)。