馮 娟，張秀利，陽玉萍，王 燕，張 華

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，烏魯木齊 830054； 2新疆烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830000)

變應(yīng)性鼻炎(allergicrhinitis，AR)是一種鼻黏膜的變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)病受到遺傳和環(huán)境因素的雙重影響，可以被認(rèn)為是一種多基因遺傳性疾病。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼RNA，在機(jī)體的一系列生理和病理過程中起到重要的作用[1-2]。近年研究表明，miRNA參與調(diào)控肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的發(fā)育、活化等生物學(xué)過程[3-4]，靶向干預(yù)這些細(xì)胞內(nèi)的miRNA表達(dá)，可成為AR基因治療的新途徑。目前，越來越多的研究者在AR患者鼻黏膜中發(fā)現(xiàn)miRNA的差異表達(dá)[5]，基于二代測序的RNA-seq分析技術(shù)可利用很少的生物樣本量進(jìn)行測序分析并能預(yù)測新的剪切體、非編碼RNA，利用高技術(shù)可進(jìn)行高通量的篩選分析。本研究采用RNA-seq分析技術(shù)，對AR患者局部鼻黏膜miRNA表達(dá)譜進(jìn)行篩選分析，分析出部分與AR發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵新預(yù)測的miRNA，為進(jìn)一步深入研究AR的發(fā)病機(jī)制、診斷及治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料及取樣所有病例來自2015年9-12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科住院患者，年齡18～50歲，性別不限，AR組為變應(yīng)性鼻炎合并鼻中隔偏曲患者，AR診斷符合2015年天津會議《變應(yīng)性鼻炎納入標(biāo)準(zhǔn)》。對照組為單純鼻中隔偏曲患者。否認(rèn)變應(yīng)性鼻炎病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性鼻-鼻竇炎、上頜竇后鼻孔息肉、支氣管哮喘和自身免疫性疾病。本研究所采用的標(biāo)本通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)，并征得患者知情同意。6例樣本的一般資料如下：1號樣本：男性，48歲，對照組；2號樣本：女性，26歲，對照組；3號樣本：男性，21歲，AR組；4號樣本：男性，36歲，AR組；5號樣本：女性，20歲，AR組；6號樣本：男性，28歲，對照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織樣本收集 剪取鼻腔黏膜組織前，用生理鹽水沖洗鼻腔，獲得樣本后，迅速將其放入RNase-free的0.9%的生理鹽水中漂洗，去除血漬和污物，將準(zhǔn)備好的凍存管裝載包裹組織。迅速投入液氮中冷卻，將樣本轉(zhuǎn)入-80℃冰箱待用。

1.2.2 組織總RNA提取與質(zhì)量檢測 選擇保存于-80℃冰箱中的鼻黏膜標(biāo)本約50 mg。至于液氮預(yù)冷的研缽中，研磨組織，采用Trizol法提取組織中RNA，采用NANO Drop 2000c分光光度計測定RNA濃度和純度，A260/A280比值1.8～2.1，濃度越高越接近2.0，采用變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA純度，在紫外光下觀察28S、18S條帶情況。

1.2.3 miRNA檢測識別及定量分析 miRNA的檢測，經(jīng)3′接頭，5′接頭，反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增，文庫擴(kuò)增等步驟，具體技術(shù)路線見圖1。

圖1 miRNA檢測識別技術(shù)路線

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布時用兩組的獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用R軟件包(版本2.13.2)進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，利用t檢驗(yàn)，以P值和誤判率(false discovery rate，F(xiàn)DR)，篩選出2組間差異表達(dá)的miRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P值和FDR值<0.05，miRNA上調(diào)判斷：均值倍數(shù)(fold change)>1，miRNA表達(dá)下調(diào)：均值倍數(shù)(fold change)<1。

2 結(jié)果

通過miRNA芯片，檢測共有172個新預(yù)測的miRNA在AR和非AR鼻黏膜組織中表達(dá)，而AR組標(biāo)本中檢測到表達(dá)的miRNA(至少在1個生物學(xué)重復(fù)中miRNA表達(dá)水平>0)共有351個(其中3、4、5號患者分別有104、113、134個miRNA表達(dá))，有84個預(yù)測的miRNA在變應(yīng)性鼻炎組共同表達(dá)。在非變應(yīng)性鼻炎組1、2、6樣品中檢測到表達(dá)的miRNA有342個(其中1、2、6號患者分別有115、100、127個miRNA表達(dá))，有85個預(yù)測的miRNA在非變應(yīng)性鼻炎組共同表達(dá)。

2.1 small RNA注釋將所有序列與rfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到其中sRNA，如miRNA、rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA和tRNA等的分布情況。以3號樣本(AR組)為例，得到的其reads長度分布圖，見圖2。

圖2 3號AR患者rfam注釋餅圖

2.2 新miRNA預(yù)測及表達(dá)量分析通過miRNA前體的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，預(yù)測miRNA，將miRNA比對到基因組序列，截取其兩側(cè)序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，通過Dicer酶結(jié)合位點(diǎn)其二級結(jié)構(gòu)的自由能的情況，預(yù)測新的miRNA。表1為本研究得到的表達(dá)量居前20位的新預(yù)測的miRNA，根據(jù)本研究結(jié)果顯示，新預(yù)測miRNA相關(guān)信息示意圖見圖3。

測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)量分布圖見圖4。

圖3 新預(yù)測miRNA相關(guān)信息示意圖

(左上角為預(yù)測得到的前體的臨時編號、各項(xiàng)得分、總的序列數(shù)以及比對到mature、loop和star區(qū)的序列數(shù)；右圖為miRNA前體預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)；中間的折線圖橫坐標(biāo)為miRNA前體序列堿基位置，縱坐標(biāo)為比對上序列頻率，下面為該miRNA前體堿基序列及其結(jié)構(gòu)編碼以及比對到該miRNA不同區(qū)域的序列信息，包括序列及序列數(shù)目、失配堿基數(shù)和所屬樣本。)

表1 新預(yù)測miRNA表達(dá)量統(tǒng)計表miRNA

圖4 下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)量分布圖

注：橫坐標(biāo)為堿基位置，縱坐標(biāo)為堿基質(zhì)量分布情況

對于得到的含有相應(yīng)index的數(shù)據(jù)，為了得到更高質(zhì)量及更精準(zhǔn)的生物信息分析結(jié)果，需要對數(shù)據(jù)做進(jìn)一步的質(zhì)控篩選。以3號樣本(AR組)患者為例，得到的其reads長度分布圖，見圖5。

圖5 3號AR患者reads長度分布圖

2.3樣本間差異表達(dá)的新預(yù)測的miRNA分析對于前面得到的新預(yù)測的miRNA根據(jù)其表達(dá)量進(jìn)行樣本間差異分析，分別用edgeR與DESeq2進(jìn)行表達(dá)量差異分析[6-7]，取二者交集作為最終結(jié)果。本研究數(shù)據(jù)得到6個新預(yù)測的miRNA(12_8883、1_337、15_10712、2_2607、5_4078、8_6355)在樣本間差異表達(dá)(P<0.05)，見表2。

表2 樣本間差異表達(dá)的新預(yù)測的miRNA

2.4 新miRNA靶基因預(yù)測對于得到的已新預(yù)測的miRNA，使用軟件miRand、RNAhybrid預(yù)測其靶基因。為了進(jìn)一步提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，使用不同軟件分別預(yù)測取最終交集作為結(jié)果。以新預(yù)測的miRNA12_8883為例，其對應(yīng)有34個靶基因，見表3。

2.5 差異表達(dá)的新預(yù)測的miRNA表達(dá)模式分析對差異表達(dá)的新預(yù)測的miRNA進(jìn)行表達(dá)模式聚類分析，以熱圖展示，見圖6。

表3 miRNA12_8883對應(yīng)的靶基因

圖6 差異表達(dá)的新預(yù)測miRNA表達(dá)聚類圖

2.6 差異表達(dá)miRNA靶基因富集差異表達(dá)miRNA與8條通路有關(guān)，分別是軸突指導(dǎo)(axon guidance)、突觸小泡循環(huán)(synaptic vesicle cycle)、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia)、胞吞作用(endocytosis)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)、Ras信號通路(Ras signaling pathway)、黑色素瘤(melanoma)和賴氨酸降解(lysine degradation)，見表4。

3 討論

新一代測序技術(shù)的出現(xiàn)，為探索生物體內(nèi)的miRNA提供了一條捷徑。利用新的測序技術(shù)，將可以獲取任意物種的全部miRNA序列信息，而不必?fù)?dān)心有所遺漏。高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing)又稱“下一代”測序技術(shù)(next-generation sequencing technology)，即二代測序，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志，高通量測序技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)百萬甚至千萬個DNA分子的并行測序，在測序通量、周期與成本上都有根本性突破。

近年來，醫(yī)學(xué)界對miRNA的研究已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展，雖然涉及AR病理機(jī)制的miRNA逐漸被發(fā)現(xiàn)，但仍有許多未知的miRNA，通過研究發(fā)現(xiàn)未知miRNA，有望成為今后miRNA的研究方向。本研究用RNA-seq分析技術(shù)，對AR患者局部鼻黏膜miRNA表達(dá)譜進(jìn)行篩選分析，最終得到172個新預(yù)測的miRNA，6個新預(yù)測的miRNA(12_8883、1_337、15_10712、2_2607、5_4078、8_6355)在樣本間差異表達(dá)(P<0.05)。進(jìn)行miRNA表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)，就是為了篩選在樣本具有重要表達(dá)功能的、能更好地體現(xiàn)差異實(shí)質(zhì)的miRNA[8]?？梢詫⒈狙芯款A(yù)測得到的差異表達(dá)的新預(yù)測的miRNA為研究基礎(chǔ)，后續(xù)研究可針對差異表達(dá)的miRNA，在細(xì)胞水平揭示變應(yīng)性鼻炎差異表達(dá)miRNA在AR發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用，進(jìn)一步研究可為AR的臨床治療提供新的方向與靶點(diǎn)。

表4 差異表達(dá)miRNA靶基因富集

京都基因和基因組百科全書(KEGG)是基因功能系統(tǒng)分析的知識庫，可以將基因組信息與高階功能信息聯(lián)系起來?；蚪M信息存儲在GENES數(shù)據(jù)庫中，該數(shù)據(jù)庫是所有完全測序的基因組的基因目錄的集合，以及具有基因功能的最新注釋的一些部分基因組。更高階的功能信息存儲在PATHWAY數(shù)據(jù)庫中，該數(shù)據(jù)庫包含細(xì)胞過程的圖形表示，如代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期等信號通路。PATHWAY數(shù)據(jù)庫由一組直系同源組表補(bǔ)充，用于保存的子途徑(途徑基序)信息，這些信息通常由染色體上的位置偶聯(lián)基因編碼，并且特別適用于預(yù)測基因功能。KEGG的第3個數(shù)據(jù)庫是LIGAND，用于獲取有關(guān)化合物，酶分子和酶促反應(yīng)的信息。本研究選取AR患者標(biāo)本，采用KEGG數(shù)據(jù)庫，對篩選出的差異表達(dá)的miRNA，采用Fisher精確檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)的統(tǒng)計學(xué)方法，將miRNA參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(簡稱pathway)進(jìn)行顯著性分析，按照P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到差異表達(dá)新的miRNA與8條通路有關(guān)，8條通路分別是軸突指導(dǎo)(axon guidance)、突觸小泡循環(huán)(synaptic vesicle cycle)、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia)、胞吞作用(endocytosis)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)、Ras信號通路(Ras signaling pathway)、黑色素瘤(melanoma)和賴氨酸降解(lysine degradation)。

用基因芯片技術(shù)對變應(yīng)性鼻炎進(jìn)行研究，篩選新的差異表達(dá)的miRNA，可以為疾病的診斷與治療提供理論依據(jù)，本研究初步分析了變異性鼻炎新預(yù)測的差異表達(dá)miRNA。證實(shí)了變異性鼻炎受多種miRNA調(diào)控，并篩選部分可能與其發(fā)病有關(guān)的新的miRNA，為下一步深入研究變異性鼻炎的發(fā)病機(jī)理以及診斷治療提供了新的思路。

現(xiàn)代研究學(xué)者普遍認(rèn)為，AR和哮喘為“同一氣道同一疾病”的結(jié)論[9-10]。AR也被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的獨(dú)立危險因素，但AR并發(fā)哮喘的機(jī)制尚未闡明，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步開展AR合并哮喘的miRNA篩查，發(fā)現(xiàn)其相關(guān)聯(lián)miRNA進(jìn)行進(jìn)一步研究。另外，本研究存在一定的不足，由于時間和實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)的限制，本組測序分析檢測的病例只有6例，通過本研究的初期研究，可進(jìn)一步研究某個或某幾個特征miRNA與AR的相關(guān)性，從而得到診斷新標(biāo)準(zhǔn)或者是AR的治療新靶點(diǎn)。