陳 婷， 成旭東， 王玳珠， 蔣 斌， 沈夕坤

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州215009）

抗病毒顆粒是蘇州市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，批準(zhǔn)文號(hào)蘇藥制字Z04001821，來(lái)源于江蘇省名中醫(yī)何煥榮主任中醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)方，由金銀花、連翹、蒲公英、野菊花、板藍(lán)根5 味藥材組成，具有清熱解毒的功效，適用于急性上呼吸道感染及病毒感染疾病，療效顯著，但原標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀鑒別及檢查項(xiàng)，無(wú)法全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量。中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，在質(zhì)量控制中僅采用單一或某幾種成分難以反映其整體特征［1-2］，故本實(shí)驗(yàn)建立抗病毒顆粒HPLC 指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷的含有量，從整體上控制該制劑質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；AG285 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-100VDE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；KDC-140HR 型超速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q Synthesis 108 型超純水儀 （美國(guó)密理博公司）。

1.2 試藥 綠原酸（批號(hào)110753-201415）、咖啡酸 （批 號(hào) 110885-201703）、 木 犀 草 苷 （批 號(hào)111720-201609）、蒙花苷（批號(hào)111528-201710）、連翹酯苷A（批號(hào)111810-201606） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院； 新綠原酸 （批號(hào)4974）、隱綠原酸（批號(hào)3208）、異綠原酸B（批號(hào)3089）、3，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)6137）、4，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)3001） 對(duì)照品均購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司?？共《绢w粒（批號(hào)150307、 150315、 150602、 150608、 151012、151018、 160120、 160128、 160203、 160901、160909、170105） 由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院提供。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -水（含0.1%甲酸） （B），梯度洗脫，程序見表1；體積流 量1.0 mL／min； 檢 測(cè) 波 長(zhǎng)320 nm； 柱 溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩帷⒚苫ㄜ諏?duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容，搖勻，即得，冷藏備用。

2.3 供試品溶液制備 將顆粒（批號(hào)170105） 研細(xì)，精密稱取0.5 g，置于錐形瓶中，加20 mL 蒸餾水稱定質(zhì)量，超聲（50 Hz） 提取30 min，放冷，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立

2.4.1 方法學(xué)考察

2.4.1.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄色譜圖，導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》 （2012 年版），測(cè)得相似度在0.997～1.000 之間，表明儀器精密度良好。

2.4.1.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，各精密吸取10 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》 （2012 年版），測(cè)得相似度在0.998 ～1.000 之間，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖， 導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》 （2012 年版），測(cè)得相似度均為1.000，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.2 共有峰標(biāo)定及歸屬 將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012 年版）， 建立指紋圖譜 （圖1）， 以樣品（170501） 為參照，經(jīng)過多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配后，平均值法生成對(duì)照指紋圖譜R，發(fā)現(xiàn)各主要色譜峰的出峰時(shí)間基本一致。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)17 個(gè)共有峰，通過對(duì)照品比對(duì)和文獻(xiàn)查閱確定其中10 個(gè)，分別為新綠原酸（2 號(hào)峰）、綠原酸（4 號(hào)峰）、隱綠原酸（5 號(hào)峰）、咖啡酸（6 號(hào)峰）、連翹酯苷A（9號(hào)峰）、木犀草苷（10 號(hào)峰）、異綠原酸B（11 號(hào)峰）、3，5-二咖啡?？鼘幩幔?2 號(hào)峰）、4，5-二咖啡酰奎寧酸（13 號(hào)峰）、蒙花苷（16 號(hào)峰）。

通過與單味藥HPLC 圖譜比較，可確定2、4 ～5、10～13 號(hào)峰來(lái)源于金銀花，6 ～7、9 號(hào)峰來(lái)源于連翹，2、4 ～6、10 ～13、15 ～17 號(hào)峰來(lái)源于野菊花，3、6～7 號(hào)峰來(lái)源于蒲公英，見圖2。

2.4.3 相似度評(píng)價(jià) 將12 批樣品色譜圖輸出為*.cdf 格式，導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》 （2012 年版），通過多點(diǎn)校正法對(duì)色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成共有模式，并在分析檢驗(yàn)?zāi)Ｊ较乱詷悠罚ㄅ?hào)20170105） 圖譜為參照，時(shí)間窗0.10，平均數(shù)法計(jì)算相似度。結(jié)果，與生成的對(duì)照?qǐng)D譜比較，12 批樣品相似度分別 為 0.995、 0.995、 0.993、 0.995、 0.992、0.992、 0.994、 0.994、 0.994、 0.980、 0.979、0.995，表明各批次之間存在較高的均一性。

圖1 12 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of twelve batches of samples

圖2 各樣品HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of various samples

2.4.4 主成分分析 將共有峰峰面積與藥材取樣量之比，即單位質(zhì)量藥材峰面積通過SPSS 17.0 軟件進(jìn)行主成分分析，以特征值大于1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到4 個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到91.131%。其中，第 一 主 成 分 λ ＝6.845， 方 差 貢 獻(xiàn) 率 為40.265%，貢獻(xiàn)率最大，包含信息最多；第二主成分λ ＝5.675，方差貢獻(xiàn)率為33.385%；第三主成分λ ＝1.879，方差貢獻(xiàn)率為11.053%；第四主成分λ＝1.093，方差貢獻(xiàn)率為6.428%，因子載荷矩陣見表2。由表可知，峰4、12、15 在第一主成分中有明顯的正相負(fù)荷，表明它們?cè)谠黾樱谝恢鞒煞衷龃?；? 在第一主成分中有明顯的逆負(fù)荷；峰7、9 在第二主成分有明顯的逆負(fù)荷，峰11 有正負(fù)荷；峰8 在第三主成分對(duì)主成分起到負(fù)相關(guān)的作用；峰1 是第四主成分中主要決定因子。

表2 因子載荷矩陣Tab.2 Loading matrices for factors

將因子復(fù)合除以主成分相對(duì)應(yīng)的特征值的平方根，可得到主成分系數(shù)表達(dá)式，并計(jì)算各樣本主成分值。以主成分1、2 分別作為橫、縱坐標(biāo)，將12批樣品標(biāo)入坐標(biāo)系中，得到空間分布圖，見圖3。由圖可知，各批樣品雖有一定距離，但并不大，未實(shí)現(xiàn)“分類”，表明它們之間存在一定差異性，但不明顯。

圖3 主成分得分圖Fig.3 Score plot for principal components

2.5 9 種成分含有量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，以各成分色譜峰計(jì)，理論塔板數(shù)大于5 000，分離度大于1.5。

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容，搖勻，即得（質(zhì)量濃度分別為333.8、440.8、 265.6、 181.4、 144.4、 222.0、 103.2、160.6、161.6 μg／mL）。

2.5.3 供試品溶液制備 同“2.3” 項(xiàng)。

2.5.4 線性關(guān)系考察 取“2.5.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，稀釋呈不同質(zhì)量濃度，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.5.5 精密度試驗(yàn) 取“2.5.2” 項(xiàng)下同一對(duì)照品溶液，在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩帷⒚苫ㄜ辗迕娣eRSD 分別為0.58%、0.57%、0.68%、0.79%、1.45%、1.17%、1.21%、0.92%、0.16%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)170105） 顆粒，按“2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩?、 蒙花苷峰面積RSD 分別為0.62%、0.70%、1.66%、1.00%、1.03%、1.18%、1.16%、0.79%及0.81%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)170105） 顆粒，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷峰面積RSD 分別為0.73%%、0.83%、0.94%、0.53%、0.88%、0.69%、 0.39%、 0.23%、 0.45%， 表 明 溶 液 在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批顆粒（批號(hào)170105）6 份，每份約0.25 g，精密加入等量對(duì)照品，按“2.5.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷平均加樣回收率分別為100.89%、101.34%、97.34%、98.36%、102.69%、100.29%、98.03%、99.64%、100.50%，RSD 分 別 為 1.48%、 1.51%、 2.16%、 1.40%、2.20%、1.86%、1.88%、0.79%、1.22%。

2.5.9 樣品含有量測(cè)定 精密稱取12 批顆粒，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論

3.1 含有量測(cè)定成分篩選 抗病毒顆粒中銀花連翹為君藥，既有辛涼透表、清熱解毒作用，又有芳香辟穢功效，臣以野菊花清熱解毒、抗病毒，佐以蒲公英加強(qiáng)解毒、清熱、清火之功，上述藥材均有抗病毒作用［3-5］。

金銀花中含有多種化學(xué)成分，主要是揮發(fā)油、黃酮、有機(jī)酸、三萜皂苷、環(huán)烯醚苷等，其中有機(jī)酸被認(rèn)為是清熱解毒物質(zhì)基礎(chǔ)，常以綠原酸為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；黃酮是抗呼吸道病毒感染有效成分［6-9］；連翹主要含有萜類、苯乙醇及其苷類、木脂素、黃酮、揮發(fā)油等化合物，以連翹苷、連翹脂素、齊墩果酸、蘆丁、連翹酯苷為主［10-11］；野菊花含有綠原酸、木犀草苷、咖啡酸［12-13］等，蒙花苷為其特征成分之一［14］；蒲公英活性物質(zhì)包括黃酮、酚酸、三萜等［15］。因此，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定綠原酸及其同分異構(gòu)體（新綠原酸、隱綠原酸）［16-17］、異綠原酸B 及其同分異構(gòu)體（3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩幔?8］、咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷的含有量，但由于連翹酯苷A 與其相鄰色譜峰的分離度小于1.5，故不對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

3.2 含有量測(cè)定方法篩選 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器的全波長(zhǎng)掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 各成分在320 nm波長(zhǎng)處均有較高吸收，而且基線平穩(wěn)，分離度高，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。然后，考察了甲醇-水、乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)后者干擾少，各成分分離度較好，為了改善峰形，在水相中又加入甲酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-水（含0.1%甲酸） 洗脫時(shí)出峰快，基線穩(wěn)定，分離度高，峰形對(duì)稱理想。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立抗病毒顆粒HPLC 指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷9 種成分含有量，該方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于該制劑質(zhì)量控制。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)色譜峰中除了所測(cè)定的指標(biāo)成分外，還存在多種分離度較好的未知成分，可通過LC-MS等分析方法作進(jìn)一步確定。