劉亞東，于時良，劉健男，安瑞華

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150001)

草酸作為代謝終產(chǎn)物，是腎結(jié)石疾病發(fā)病機理中的重要影響因素[1]。高濃度的草酸會導致腎小管上皮細胞損傷，增加細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成[2-3]。腎小管細胞中ROS的生成主要來源于線粒體和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)氧化酶，而線粒體功能紊亂被認為是草酸引起腎小管細胞損傷的關(guān)鍵[4]。所以具有抗氧化作用的藥物被廣泛用于防治腎小管損傷和腎結(jié)石形成[5]。

西紅花苷是一種水溶性的類胡蘿卜素，主要提取于梔子花、番紅花[6]。許多藥理研究已經(jīng)證實了其具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、增加免疫的功能[7-8]。HADEER等[9]的研究證實西紅花苷可以通過抑制氧化應激來緩解大鼠糖尿病腎的病情進展。但其在草酸鈣腎結(jié)石防治中的研究尚鮮見相關(guān)報道。

本文從細胞試驗層面多個角度研究西紅花苷是否可抑制腎小管細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的形成，從而為西紅花苷等中成藥在腎結(jié)石疾病的防治中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料高糖DMEM合成液體培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，草酸(美國Sigma公司)，西紅花苷(源葉生物公司)，兔抗人鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體、兔抗人波形蛋白(Vimentin)、兔抗人N鈣黏蛋白(N-cadherin)單克隆抗體(萬類生物公司)、兔抗人轉(zhuǎn)化生長因子β1(transform growth factor β1，TGF-β1)抗體(Proteintech公司)、兔抗人核因子-κB (Nuclear factor kappa B，NF-κB)抗體(Cell Signaling Technology公司)，小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(中杉金橋公司)，活性氧檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)犬遠端腎小管上皮細胞(Madin-darby canine kidney，MDCK)購自于中科院上海細胞庫。將其培養(yǎng)于含10%胎牛血清和雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。待細胞生長至覆蓋率為80%左右時分別予以草酸和西紅花苷進行處理。研究共分為3組：正常對照組、草酸干預組、草酸+西紅花苷干預組。

1.3 Western blot細胞模型構(gòu)建完成后提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠法配制成10%的15孔凝膠。然后依次電泳、電轉(zhuǎn)，用含5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后孵育E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、NF-κB抗體1 h，4℃冰箱過夜，次日搖床再次孵育1 h。再以PBST洗滌(每次10 min，共3次)后用HRP標記的二抗孵育1 h，再次用PBST洗滌后將PVDF膜放入Bio-Rad成像儀，選擇合適的參數(shù)，滴加ECL發(fā)光液后進行顯影，對結(jié)果運用Image Lab軟件分析處理。

1.4 ROS檢測細胞種植于6孔板中，待細胞生長覆蓋率達到80%左右時，胰酶將細胞消化下來后放于15 mL無菌無酶離心管中，然后懸浮狀態(tài)下分別予以相應藥物刺激干預2 h。誘導完畢后先離心，然后用無血清培養(yǎng)液懸浮后再次離心，將殘留的藥物洗除。再次離心后加入含DCFH-DA探針的無血清培養(yǎng)液將離心管中細胞重懸，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，期間每間隔3～5 min吹打混合一次。然后各組取相同數(shù)目的細胞重懸于500 μL的PBS中。再用200目濾網(wǎng)過濾轉(zhuǎn)移至流式BD管中，適度搖勻后上機檢測。結(jié)果用流式分析軟件分析計算，所有實驗操作均3次以上。

1.5 細胞內(nèi)SOD、MDA水平的測定SOD可以清除超氧陰離子自由基從而保護細胞免受損傷。由黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)所產(chǎn)生的超氧陰離子自由基可氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈紫紅色，在550 nm處用酶標儀測其吸光度。計算公式為：0.5×(對照A值-測定A值)/(對照A值)×反應體系稀釋倍數(shù)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。因此可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度。MDA-TBA加合物在535 nm處有最大吸收，據(jù)此可以通過比色法進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 各組干預后ROS發(fā)生率流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)(圖1)，與正常組相比草酸會使ROS發(fā)生率增加4～5倍。而與草酸組相比，西紅花苷組會降低草酸誘導所產(chǎn)生的ROS。

圖1 各組干預后ROS發(fā)生率

A：流式細胞儀檢測圖；B：柱狀圖。*與正常組相比，P<0.05。

2.2 蛋白的表達情況與正常組相比，草酸干預會使波形蛋白(Vimentin)、神經(jīng)-鈣黏蛋白(N-cadherin)、TGF-β1、NF-κB表達升高；而上皮相關(guān)蛋白(E-cadherin)的表達在草酸組會降低(圖2A～F)。

2.3 各組SOD、MDA表達量草酸可損傷腎小管上皮細胞，而西紅花苷可緩解草酸所帶來的損傷，故草酸組MDA的表達量高于正常對照組、西紅花苷干預組。但SOD在草酸組的表達量降低，西紅花苷組表達較草酸組增加(圖3)。

圖2 各組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、NF-κB蛋白的表達

A：E-cadherin(E-鈣黏蛋白)、N-cadherin(N-鈣黏蛋白)、Vimentin(波形蛋白)、TGF-β1(轉(zhuǎn)化因子β1)、NF-κB(核因子-κB)蛋白的表達條帶圖；B、C、D、E、F分別為E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、NF-κB蛋白表達水平柱狀圖。與草酸組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖3 各組SOD、MDA表達量

A：SOD(超氧化物歧化酶)各組表達水平；B：MDA(丙二醛)表達水平。*與正常組相比，P<0.05；**：與草酸組相比，P<0.01。SOD：超氧化物歧化酶。

3 討 論

草酸鈣結(jié)晶在腎結(jié)石成分中占有80%左右，在結(jié)石形成過程中，草酸鈣結(jié)石經(jīng)歷結(jié)晶的生成、聚集最終粘附于腎小管上皮細胞上[10]。既往動物和細胞實驗已經(jīng)證實高濃度的草酸會增加細胞內(nèi)的氧化應激，并且是腎上皮細胞損傷起始和進展的因素之一[11]。同時，活性氧導致的腎小管細胞和動物模型腎臟的損傷反過來會進一步促使草酸鈣腎結(jié)石的形成[12]。因此，關(guān)于抗氧化劑緩解草酸造成的細胞損傷被大量的研究。

由TGF-β刺激所導致的EMT改變了基因表達，減弱了細胞粘附，觸發(fā)了細胞骨架動力學的變化，并使得上皮細胞的形態(tài)和生理功能改變?yōu)殚g質(zhì)細胞的表型[13]。EMT包括E-cadherin表達和功能的減弱，同時間質(zhì)化的指標N-cadherin、Vimentin表達增加。EMT在組織修復、腫瘤生長和侵襲中發(fā)揮了重要作用[14]。DENG等[13]的研究證實了起始于腎小管上皮細胞的腎結(jié)石與高濃度的草酸鈣環(huán)境和TGF-β1刺激導致的EMT有關(guān)。而我們的研究也表明高濃度的草酸可激活TGF-β1，進而促進腎小管上皮細胞發(fā)生EMT。

西紅花苷作為番紅花主要生物活性組成部分，許多研究已經(jīng)證實其具有抗凋亡、抗氧化的作用[15]。具有抗氧化自由基作用的SOD能夠抑制脂質(zhì)過氧化反應，從而減弱氧化應激對細胞的損傷。此外MDA作為脂質(zhì)過氧化反應的指標，可以反映細胞氧化損傷的程度[16]。圖3可見西紅花苷緩解了草酸干預引起的MDA增加和SOD的減弱。該結(jié)果和流式ROS檢測相一致，均可以證明西紅花苷抑制草酸引起的應激損傷。故實驗結(jié)果可以證實西紅花苷可降低草酸干預造成的氧化應激損傷，并且可通過抗氧化作用抑制TGF-β1的表達，進一步抑制草酸引起的腎小管上皮細胞的EMT。

NF-κB是炎性反應中的重要信號轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)免疫和分化的功能[17]。當細胞處于正常生理狀態(tài)時，NF-κB主要表達在細胞質(zhì)上，并且被IκB阻止其功能。但當細胞被細胞因子、病毒、氧化應激等刺激后NF-κB被激活并轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的作用[18]。既往很多研究證實NF-κB與細胞很多信號轉(zhuǎn)導有關(guān)，并在腎間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮重要作用[19]。NF-κB廣泛表達于腎小球和腎小管上皮細胞。草酸激活后的NF-κB能調(diào)節(jié)炎性反應，上調(diào)各種炎性因子的表達，最終促使腎小管上皮細胞的EMT[20]。因此我們檢測西紅花苷是否能通過抑制NF-κB通路拮抗草酸引起的腎小管細胞炎性反應。我們的研究證實與草酸組相比，NF-κB表達量在草酸組會增加。所以西紅花苷抑制了NF-κB的表達，抑制了EMT的發(fā)生。

本研究從細胞實驗層面初步證實了西紅花苷可以通過TGF-β1、NF-κB通路抑制草酸引起的腎小管細胞EMT，為其在草酸鈣腎結(jié)石的防治中提供了新的思路。但西紅花苷在動物模型中是否會有同樣的作用需要我們進一步研究。