王振龍，張 鵬，薛玉泉，張亞萍，楊小杰，薛 力，李和程，李洪亮，劉文聘，種 鐵

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004)

腎癌(renal cell carcinomar，RCC)是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，發(fā)病率逐年上升，每年增長約2%～4%，即使手術治療，術后仍有約20%～40%的患者出現(xiàn)疾病進展，5年生存率僅有11%[1-2]。尋找合適的評價腎癌治療效果的方法，實時監(jiān)測腎癌治療后的轉歸，對腎癌治療后的疾病進展做到早發(fā)現(xiàn)早治療意義重大。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是實體瘤原發(fā)灶或轉移灶釋放進入外周循環(huán)血中的腫瘤細胞，被認為是腫瘤轉移的“種子”。研究表明，CTCs與多種腫瘤的轉移和復發(fā)顯著相關[3-4]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)了CTCs數(shù)量及分型檢測具有評估腎癌進展風險的作用[5]。CTCs數(shù)量及分型檢測能否作為評價腎癌療效的早期、敏感的方法，值得深入研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料入組患者為2015年6月至2016年9月西安交通大學第二附屬醫(yī)院收治的47例腎癌患者，均經(jīng)病理學確診且既往未經(jīng)任何治療。年齡47～82歲，平均 64.5 歲；男性33例，女性14例；TNM 分期采用國際抗癌聯(lián)盟2003年制定的標準：T1期 34 例，T2期 10 例，T3期 3 例，無T4期病例；手術方式：根治性腎切除術10例，腎部分切除術37例；術后病理診斷：腎透明細胞癌45例，乳頭狀細胞癌2例。本研究通過了西安交通大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核，標本的采集和檢測均經(jīng)患者知情同意。

1.2 監(jiān)測與隨訪所有患者行術前檢查并進行CTCs檢測，術中記錄腫瘤分級分期等信息，術后每3個月復查一次，檢查項目包括，胸部、上腹部及雙腎計算機斷層掃描(computed tomography，CT)平掃或增強(懷疑有轉移及復發(fā)患者加做增強CT)檢測評估腫瘤有無遠處轉移；外周血CTCs檢測，包括CTCs數(shù)量及分型檢測，分別得到CTCs總數(shù)及上皮型、混合型、間質型CTCs數(shù)量，并計算間質型CTCs比例(間質型CTCs數(shù)量/CTCs總數(shù))。腎癌轉移患者在給予治療前及治療后1月增加外周血CTCs分型檢測，后續(xù)常規(guī)復查每3個月1次，均完成至少1年隨訪。

1.3 研究分組按以下方案進行分組：①影像學發(fā)現(xiàn)遠處轉移的患者，按進行治療(包括切除轉移灶或靶向治療)和未予治療分組，比較CTCs數(shù)量及間質型CTCs比例在2組患者中的差異，評價CTCs分型檢測對轉移腎癌療效評價的作用。②CTCs呈進展趨勢的患者(不論影像學是否發(fā)現(xiàn)轉移灶)，按進行分子靶向治療和未進行靶向治療分組，比較CTCs數(shù)量及間質型CTCs比例在2組患者中的差異，評價分子靶向治療對CTCs數(shù)量及分型的作用。

1.4 分子靶向治療方案分子靶向藥物治療用藥及輔助治療用藥，均選擇索拉非尼0.8 g/d口服。

1.5 外周血CTCs數(shù)量及CTCs分型檢測方法(納米膜過濾、RNA原位雜交法)

1.5.1樣本采集 使用8號采血針和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝采血管采集7.5 mL外周血。將樣本保存管插入孔內(nèi)，使孔中針頭刺穿樣本保存管橡膠塞，EDTA抗凝采血管內(nèi)的血液將自動輸入樣本保存管內(nèi)。待樣本保存管內(nèi)的液面不再上升后，拔出樣本保存管，上下顛倒混勻10次，室溫放置30 min。

1.5.2CTCs的分離富集 離心去除上清，固定劑固定8 min。通過真空歧管將過濾器與真空泵連接，將樣本保存管中的液體轉移至納米膜過濾器中，甲醛溶液室溫固定60 min。

1.5.3上皮型、混合型、間質型CTCs的分型鑒定 固定后的樣本進行探針雜交CTCs分型鑒定。透化劑孵育5 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次。消化酶孵育60 min，PBS洗滌3次。加入探針工作液，(40±1)℃孵育3 h，洗滌3次。加入預擴增工作液，(40±1)℃孵育30 min，洗滌3次。加入擴增工作液，(40±1)℃孵育30 min，洗滌3次。加入顯色工作液，(40±1)℃孵育30 min，洗滌3次，在樣本上加抗淬滅劑(含DAPI)。

CTCs分型檢測技術采用多重RNA探針，分別針對上皮型CTCs特異性基因EpCAM、CK8、CK18、CK19，間質型CTCs特異性基因Vimentin、Twist進行檢測(探針序列見表1)。使用擴增探針與標記有熒光基團的上述分型標記探針進行雜交，產(chǎn)生熒光信號，利用自動識別系統(tǒng)閱讀熒光信號，通過不同顏色熒光信號，自動判斷CTCs分型檢測結果。免疫熒光檢測標準判讀：上皮型CTCs顯示為紅色熒光信號點，間質型CTCs顯示為綠色熒光信號點，同時表達上皮型和間質型特異性基因的CTCs為混合型(同時顯示紅色熒光及綠色熒光信號點)。

表1 核酸探針序列

基因序列(5′→3′)EpCAMTGGTGCTCGTTGATGAGTCAAGCCAGCTTTGAGCAAATGAAAAGCCCATCATTGTTCTGGCTCTCATCGCAGTCAGGATCTCCTTGTCTGTTCTTCTGACCTCAGAGCAGGTTATTTCAGCK8CGTACCTTGTCTATGAAGGAACTTGGTCTCCAGCATCTTGCCTAAGGTTGTTGATGTAGCCTGAGGAAGTTGATCTCGTCCAGATGTGTCCGAGATCTGGTGACCTCAGCAATGATGCTGCK18AGAAAGGACAGGACTCAGGCGAGTGGTGAAGCTCATGCTGTCAGGTCCTCGATGATCTTGCAATCTGCAGAACGATGCGGAAGTCATCAGCAGCAAGACGCTGCAGTCGTGTGATATTGGCK19CTGTAGGAAGTCATGGCGAGAAGTCATCTGCAGCCAGACGCTGTTCCGTCTCAAACTTGGTTCTTCTTCAGGTAGGCCAGCTCAGCGTACTGATTTCCTCGTGAACCAGGCTTCAGCATCVimentinGAGCGAGAGTGGCAGAGGACCTTTGTCGTTGGTTAGCTGGCATATTGCTGACGTACGTCAGAGCGCCCCTAAGTTTTTAAAAGATTGCAGGGTGTTTTCGGGCCAATAGTGTCTTGGTAGTwistACAATGACATCTAGGTCTCCCTGGTAGAGGAAGTCGATGTCAACTGTTCAGACTTCTATCCCTCTTGAGAATGCATGCATTTTCAGTGGGCTGATTGGCACTTACCATGGGTCCTCAATAACD45TCGCAATTCTTATGCGACTCTGTCATGGAGACAGTCATGT

1.5.4檢測結果的判讀標準 本研究將CTCs數(shù)量及間質型CTCs比例同時增加認為CTCs進展；CTCs數(shù)量及間質型CTCs比例同時減少認為CTCs下降；CTCs數(shù)量及間質型比例變化趨勢不相符定義為CTCs趨勢待定。

1.6 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進行分析，連續(xù)性變量使用均值、標準差以及波動范圍的表示方法，類別變量使用頻數(shù)進行表示，連續(xù)性變量根據(jù)是否符合正態(tài)分布采用t檢驗或秩和檢驗，類別變量采用Pearsonχ2檢驗或Fisher’s確切概率檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 CTCs分型檢測對腎癌治療的實時監(jiān)測作用

1例腎癌(T1bN0M0)行根治性腎切除患者，術后3月檢測CTCs呈現(xiàn)進展趨勢，給予分子靶向藥物索拉菲尼輔助治療0.8 g/d，持續(xù)用藥3個月后停藥，復查CTCs數(shù)量及間質型CTCs比例均呈現(xiàn)下降趨勢。但在術后15個月(即停用輔助治療后9個月)，檢測CTCs數(shù)量及間質型CTCs比例再次呈現(xiàn)上升趨勢，影像學檢查未見異常，術后18個月CT發(fā)現(xiàn)肺轉移，與影像學檢測比較，CTCs能提早3個月發(fā)現(xiàn)腫瘤的進展。給予索拉菲尼靶向治療，術后21月(即靶向治療3月后)復查CTCs較治療前呈現(xiàn)下降趨勢，術后24月(即靶向治療6月后)胸部CT顯示轉移灶由治療前最大徑13 mm縮小至10 mm，縮小23.07%，CTCs呈現(xiàn)的下降趨勢比影像學發(fā)現(xiàn)轉移灶縮小提早3個月(圖1)。

1例左腎癌(T2N0M0)患者行左腎根治性切除術，術后3個月發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)量及間質型細胞比例增加，影像學檢查未發(fā)現(xiàn)異常；術后6個月CT及PET-CT發(fā)現(xiàn)右側腎上腺轉移，予右腎上腺轉移灶切除，患者未同意應用分子靶向治療，術后CTCs呈現(xiàn)下降趨勢。術后24個月復查時發(fā)現(xiàn)CTCs再次出現(xiàn)進展趨勢，同時CT發(fā)現(xiàn)左側腎上腺轉移灶，予左側腎上腺切除，聯(lián)合分子靶向治療，治療后CTCs呈現(xiàn)下降趨勢(圖2)。以上2例接受CTCs監(jiān)測的個案病例，提示CTCs分型檢測具有實時、早期評價疾病進展及治療轉歸的作用。

圖1 腎癌術后肺轉移患者CTCs變化及CT表現(xiàn)

A：CTCs隨訪監(jiān)測結果柱狀圖；B：術前腎CT軸位圖(示左腎中部55×47 mm腎門腫瘤)；C：分子靶向治療前(示肺轉移灶表現(xiàn)，轉移灶最大徑13 mm)；D：分子靶向治療半年后(肺轉移灶較治療前最大徑縮小至10 mm)。AT：分子靶向輔助治療；T：分子靶向治療。

圖2 左腎癌術后腎上腺轉移患者CTCs變化及CT表現(xiàn)

A：CTCs隨訪監(jiān)測結果柱狀圖；B：術前PET-CT示原發(fā)左腎癌；C：左腎根治性切除術后6月PET-CT發(fā)現(xiàn)右腎上腺占位，行右腎上腺腫瘤切除，術后病理證實右腎上腺轉移癌；D：術后24月CT發(fā)現(xiàn)左腎上腺腫瘤，行左腎上腺切除，術后病理證實左腎上腺轉移癌；E：左腎上腺轉移瘤切除術后復查CT，未見局部異常。RAC：發(fā)現(xiàn)右腎上腺轉移，行轉移灶切除；LAC：發(fā)現(xiàn)左腎上腺轉移，行轉移灶切除。

2.2 CTCs分型檢測對轉移腎癌療效評價的作用47例患者均完成12～27個月的隨訪，平均隨訪時間(13.0±8.5)個月。其中5例在隨訪期發(fā)生遠處轉移(1例腎上腺轉移，4例肺轉移)。轉移患者中，3例給予治療(1例腎上腺轉移給予轉移灶切除，2例肺轉移給予分子靶向治療)，治療后CTCs數(shù)量及間質型比例較治療前呈下降趨勢；2例因患者原因未接受治療，CTCs總數(shù)及間質型CTC比例均呈進展趨勢。

2.3 分子靶向治療對CTCs數(shù)量及分型的作用16例CTCs呈進展趨勢的患者中，11例未予干預，8例患者CTCs繼續(xù)進展。5例患者給予索拉菲尼分子靶向治療(2例為晚期治療，3例為術后輔助)，治療后檢測CTCs數(shù)量及間質型CTCs比例較治療前均呈下降趨勢(27.00±8.74vs.11.40±2.07；0.81±0.02vs.0.33±0.05)。靶向治療組CTCs呈現(xiàn)下降趨勢的患者比例高于未治療組(表2)。

表2 靶向治療與CTCs分型檢測結果[例(%)]

3 討 論

對腎癌的進展早發(fā)現(xiàn)早治療，并對治療效果進行實時、有效的評價意義重大[6]。目前腎癌監(jiān)測手段主要靠影像學檢查，但影像學檢查對腎癌的進展及療效判斷具有滯后性，腫瘤體積發(fā)生一定變化后才會被影像學發(fā)現(xiàn)，不利于治療效果的及時評價。尋找一種能夠在治療過程中對腫瘤進行重復監(jiān)測，實時了解腫瘤治療效果及進展風險的檢查手段，對腎癌的治療至關重要。

研究發(fā)現(xiàn)，CTCs與乳腺癌、結直腸癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤的轉移和復發(fā)顯著相關[3]。CTCs檢查僅需抽取少量外周血，具有取樣簡單、可重復性強、無創(chuàng)等諸多優(yōu)點，對早期發(fā)現(xiàn)腫瘤微轉移、評估預后和療效以及腫瘤的個體化治療具有重要意義[7]。在無法通過現(xiàn)有診斷模式如CT和PET-CT發(fā)現(xiàn)遠處轉移的患者中，約20%的患者可檢測到CTCs，CTCs檢測可以比CT、PET更早、更有效地診斷腫瘤復發(fā)和轉移[8]。腎癌方面，我們前期研究發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)量及間質型CTCs比例的增加趨勢與腎癌的進展轉移具有顯著相關性[5]。

一些研究發(fā)現(xiàn)，CTCs數(shù)量檢測可評價腫瘤治療效果。結直腸癌根治術后CTCs數(shù)量繼續(xù)增加，則提示腫瘤復發(fā)轉移的危險性增加[9]。對接受化療的進展期結直腸癌患者研究發(fā)現(xiàn)，通過CTCs檢測，可以有效地預測患者的OS[10]。在前列腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，與PSA檢測相比，CTCs能夠更早地預測患者從治療中的獲益程度，在治療的第2～5周PSA尚未有顯著變化時，CTCs數(shù)量就出現(xiàn)具有統(tǒng)計學差異的變化，提示CTCs數(shù)量檢測是早期，敏感的療效評價指標。其次，通過ROC曲線對比CTCs數(shù)量和PSA的預測準確性，發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)量對治療效果的預測準確性要比PSA更有優(yōu)勢[11]。

但在一些研究中發(fā)現(xiàn)，單純的CTCs數(shù)量變化與治療后疾病轉歸并不相符，CTCs分型檢測中間質型CTCs的比例變化也同樣重要。發(fā)表在Science上的一篇針對乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，在接受治療的腫瘤緩解病例中，仍有部分患者CTCs數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢，另有一些患者即使治療后CTCs數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢，但疾病仍出現(xiàn)臨床進展[12]。出現(xiàn)這種結果的原因是CTCs在形成過程中伴隨著上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，使得外周血循環(huán)腫瘤細胞包含上皮型、間質型和上皮/間質混合型的三種類型，與上皮型CTCs相比，間質型CTCs具有更強的侵襲轉移能力，在腫瘤的轉移過程同樣起主要作用[13-15]。因此，僅僅依靠CTCs的數(shù)量不能準確評估腫瘤進展風險，還需要結合CTCs分型，即間質型CTCs的數(shù)量和比例來綜合評估。上述乳腺癌研究中治療后腫瘤進展病例中，雖然CTCs數(shù)量降低，但間質型細胞比例出現(xiàn)了增加；疾病緩解的病例中，雖然有CTCs數(shù)量的增加，但間質型細胞的比例卻呈下降趨勢，提示間質型CTCs比例的增高與乳腺癌預后呈負相關性[12]。因此，本研究在CTCs結果認定中，認為CTCs的進展或下降不僅表現(xiàn)為CTCs數(shù)量的增加或減少還應同時包括間質型CTCs比例的增高或降低。CTCs數(shù)量與間質型細胞比例出現(xiàn)相反趨勢時，則認為趨勢待定，需繼續(xù)嚴密監(jiān)測CTCs變化。本研究入組的5例轉移性腎癌患者，2例未予治療，3例給予轉移灶切除或分子靶向治療，其CTCs數(shù)量及間質型CTCs比例的變化趨勢與腫瘤預后的關系，證實了CTCs檢測是評價晚期腎癌治療的有效方法。

CTCs數(shù)量及分型檢測是否可以作為實時監(jiān)測治療效果的手段，是評價CTCs檢測臨床價值的另一重要因素。研究認為，CTCs檢測對乳腺癌的治療具有實時監(jiān)測作用[12]。我們研究中的2例治療轉歸頗為復雜的轉移性腎癌個案，1例發(fā)生2次遠處轉移，1例進行2次靶向治療。其CTCs檢測的變化趨勢與臨床治療轉歸一致，且CTCs檢測均比影像學提早發(fā)現(xiàn)疾病的變化趨勢，證實了CTCs檢測對腎癌治療的評價更具有早期、靈敏的優(yōu)勢。

分子靶向治療對腎癌CTCs作用的研究文獻不多。MUSELLA等[16]對結直腸癌患者應用西妥昔單抗、帕尼單抗靶向治療并進行CTCs檢測發(fā)現(xiàn)，治療后CTCs陰性的患者比陽性者具有更長的無進展生存期。本研究發(fā)現(xiàn)，16例CTCs進展趨勢的患者中，5例給予分子靶向治療，其中2例屬于轉移性腎癌治療用藥，3例屬于未轉移的輔助靶向治療，治療后CTCs均呈顯著下降的趨勢。11例未予干預治療，其中8例患者CTCs呈現(xiàn)進展趨勢，靶向治療組CTCs呈現(xiàn)下降的患者比例高于未治療組。說明分子靶向治療具有降低腎癌患者CTCs數(shù)量及間質型CTCs比例的作用。

綜上，我們認為CTCs具有評價腎癌治療效果的作用，CTCs數(shù)量及間質型細胞比例的下降與治療有效相關。分子靶向治療具有降低腎癌CTCs數(shù)量及間質型CTCs比例的作用。CTCs分型檢測具有早期、靈敏的優(yōu)勢，可以作為實時監(jiān)測治療效果及疾病進展的手段。但本課題分子靶向治療的例數(shù)較少，結果難免存在偏差，有待選取更大樣本量進一步驗證。

致謝：感謝輝瑞醫(yī)學部宋旸博士給予的文獻支持!