閆常帥，陳江瓊，王笑一，胡芳，張杰△

壓力性損傷（pressure injury，PI）是醫(yī)院、社區(qū)及養(yǎng)老機構(gòu)中長期臥床患者最常見的并發(fā)癥，也是嚴重的護理不良事件。其中2 期壓力性損傷最為常見，極易發(fā)展成慢性難愈性傷口，后期合并感染、敗血癥、全身衰竭，大大增加了患者死亡率。壓力性損傷的治療和護理非常棘手，國內(nèi)學者在影響因素、評估量表、風險預測模型等方面做出了充分的研究，但其臨床應用仍十分有限。近年來，以動物模型為基礎(chǔ)的實驗性研究逐漸得到國內(nèi)外學者的關(guān)注。研究表明，整合素αvβ3在腫瘤、炎癥、創(chuàng)面愈合等過程中均呈高表達，有促新生血管生成的作用［1］，而炎癥反應和新生血管的生成是壓力性損傷形成及愈合過程中的重要病理過程，但整合素αvβ3在壓力性損傷中的作用鮮有報道。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）三肽序列可以與整合素αvβ3特異性結(jié)合，是靶向藥物制備中較為成熟的靶頭［2］。隨著分子影像學的發(fā)展，超聲造影成為評估皮膚腫瘤和創(chuàng)面損傷的新手段［3-4］，若壓力性損傷創(chuàng)面有整合素αvβ3的表達，將RGD 靶向超聲造影劑用于壓力性損傷的評估，可能實現(xiàn)靶向顯影和靶向給藥，為壓力性損傷評估和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD 大鼠36 只，SPF 級，體質(zhì)量（200±10）g，飼養(yǎng)于清潔明亮、溫度（25±2）℃、濕度（50±5）%、通風良好的動物房，自由飲水取食。適應性飼養(yǎng)1周后按照隨機數(shù)字表法分為實驗組和對照組，每組18只。

1.2 主要儀器和試劑 圓形磁鐵（10 mm×2 mm，1.9 g，1 450 Gs）、彩色多普勒超聲診斷儀（Esaote MyLab Class C，意大利）。10%水合氯醛、脫毛膏（Veet 公司，法國），兔抗整合素αvβ3多克隆抗體（北京博奧森），二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC，Avanti 公司，美國），二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽偶聯(lián)二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（RGD-PEG2000，corden公司，瑞士）。

1.3 模型的建立及標本留取 2組大鼠以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，去除臀部毛發(fā)，備皮范圍約5 cm×4 cm，脫毛膏脫毛后涂抹一層凡士林。實驗組大鼠麻醉清醒后，采用皮膚橋法造模［5］，提起備皮區(qū)域皮膚，將2 片圓形磁鐵吸附于皮褶兩側(cè)，壓迫2 h，造成局部皮膚缺血，然后移除0.5 h，使缺血皮膚再灌注，此為1個循環(huán)，每日循環(huán)4次，夜間保持壓迫狀態(tài)至次日，然后先移除磁鐵0.5 h，再開始新的循環(huán)，連續(xù)壓迫3 d。期間對照組除備皮外不做任何處理。3 d后根據(jù)2016年美國國家壓瘡咨詢小組（NPUAP）最新發(fā)布的分期系統(tǒng)［6］，評估實驗組大鼠創(chuàng)面是否達到2 期壓力性損傷的標準。成模標準為部分皮層缺失，真皮層暴露；傷口床基底面為粉紅色或紅色，濕潤，也可出現(xiàn)完整或破裂的血清性水皰；脂肪層和深部組織未暴露，無肉芽組織、腐肉和焦痂。實驗組大鼠處理完畢后剪取包括創(chuàng)緣在內(nèi)圓形皮膚組織（直徑約為12 mm），對照組大鼠剪取相同部位和大小的正常皮膚組織，均用10%福爾馬林浸泡固定。

1.4 檢測方法

1.4.1 HE染色 取充分固定的皮膚標本，石蠟包埋，切片厚度為5 μm。依照常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染核，鹽酸乙醇分化，淡氨水返藍，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后于光鏡下觀察。

1.4.2 免疫組化染色檢測整合素αvβ3的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS溶液浸泡5 min，0.1 mmol/L 枸櫞酸緩沖液煮沸修復抗原，3%H2O2去離子水孵育15～20 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉15 min。滴加兔抗整合素αvβ3一抗（1∶400稀釋）于4 ℃冰箱過夜。次日滴加二抗，常規(guī)DAB 顯色，中性樹膠封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。顯微鏡下每張切片選擇4 個高倍鏡視野（×400）觀察并拍照，其中2 個皮膚表層，2個新生血管。

1.5 超聲造影劑的制備和靶向效果評估

1.5.1 RGD 靶向納米泡和空白納米泡的制備 精確稱量DPPC（5 mg）、RGD-PEG2000（2 mg）、DSPE-PEG2000（1 mg），溶于0.5 mL 含10%甘油的PBS 溶液，渦旋混合器混勻，密閉容器中充入全氟化碳惰性氣體，然后置于銀汞膠囊震蕩器震蕩50 s，形成RGD靶向納米泡，即RGD靶向超聲造影劑（粒徑468 nm，電位-4.2 mV）。取等質(zhì)量的DPPC 和DSPEPEG2000 按上述方法制得空白納米泡（粒徑482 nm，電位-3.5 mV）。

1.5.2 RGD 靶向超聲造影劑的靶向效果評估 實驗組大鼠成模后均行超聲造影檢查。大鼠麻醉后俯臥位固定，暴露創(chuàng)面，選用LA523高頻線陣探頭，用自制支架固定，調(diào)整探頭位置，至良好切面，儀器各項參數(shù)在整個實驗過程中不變。經(jīng)尾靜脈分別注射空白納米泡和RGD 靶向納米泡0.5 mL（2×107/mL），2次注射間隔至少10 min，以確保第1次注射的造影劑完全消退后再注射第2 次。注射后即刻啟動動態(tài)存儲功能，待造影劑注入后30 s，將超聲診斷儀切換至flash模式，給予超聲空化［機械指數(shù)（MI）=0.3］，爆破局部納米泡，再次切換至造影模式，待再次灌注后3 min，記錄全部造影數(shù)據(jù)。超聲造影檢查結(jié)束后，每個視頻取4個灌注較穩(wěn)定的位置，測量空化前后造影增強強度（intensity，I，dB）并計算差值，即靶向黏附值（ΔI）=空化前I值-空化后I值。

1.6 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 成模情況 實驗組18 只大鼠均成功制備2 期壓力性損傷模型，皮膚創(chuàng)面變薄，紅色，淤血，邊緣水腫，真皮受損缺失，未見皮下組織暴露，達到2 期壓力性損傷標準；對照組皮膚未見明顯變化，見圖1。

2.2 2組大鼠皮膚組織病理學變化 對照組復層鱗狀上皮、表皮、真皮、皮下組織結(jié)構(gòu)清晰，真皮層毛囊、皮脂腺等數(shù)量較多，見圖2A；真皮層纖維致密，無炎癥細胞浸潤，見圖2B。實驗組皮膚表面凹凸不平，部分上皮結(jié)構(gòu)斷裂或缺失，未缺失部分鱗狀上皮壓縮變薄，部分壞死，細胞層次減少，結(jié)構(gòu)不清，見圖2C；真皮層內(nèi)毛囊以及皮膚附屬器明顯減少，纖維排列紊亂，可見大量炎癥細胞浸潤，見圖2D。

Fig.1 The rat skin appearance of control group and experimental group圖1 2組大鼠皮膚外觀

2.3 2組大鼠整合素αVβ3表達情況 2組大鼠皮膚組織除皮脂腺存在非特異性染色外，實驗組大鼠皮膚組織中血管內(nèi)皮細胞、表皮細胞均見棕黃色染色，整合素αvβ3呈陽性，對照組未見棕黃色染色，整合素αvβ3表達呈陰性，見圖3。

2.4 RGD 靶向超聲造影劑的靶向效果評估 二維超聲下，實驗組創(chuàng)面皮膚可見凹形下陷，創(chuàng)緣水腫增厚。注入空白納米泡后，可見肌肉層先增強，然后向皮膚層緩慢灌注，皮膚層創(chuàng)緣增強稍快于創(chuàng)面且較穩(wěn)定，強度略高于創(chuàng)面，組織壞死或血管閉塞區(qū)域可見充盈缺損，見圖4A。超聲空化后，增強強度與空化前未見明顯差別，見圖4B。注入RGD靶向納米泡后，灌注過程與空白納米泡相同，但是增強強度略高于空白納米泡，見圖4C。RGD靶向納米泡給予超聲空化后，增強強度略低于空化前，見圖4D。RGD 靶向納米泡靶向黏附值明顯高于空白納米泡，見表2。

3 討論

傳統(tǒng)觀念認為，壓力性損傷的形成是由于局部受壓引起缺血缺氧，造成代謝產(chǎn)物堆積，細胞壞死。但近年研究發(fā)現(xiàn)，除缺血損傷外，再灌注造成的損傷是更重要的因素［7］。皮膚對缺血的耐受力雖然強于心、腦、腎等器官，但皮膚PI具有反復多次損傷和長期累積的特殊效應。本研究中動物模型的構(gòu)建采用皮膚橋法，且設(shè)置壓迫2 h，放松0.5 h的缺血再灌注周期，最大限度地模擬了臨床中PI的形成過程。

整合素家族是細胞表面重要的黏附和信號傳導受體，在調(diào)控細胞的黏附、增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡過程中有重要作用［8］。該家族是由許多結(jié)構(gòu)和功能相似的蛋白質(zhì)組成的一系列膜受體，每個整合素分子都是由α 和β 這2 條鏈（亞基）通過非共價鍵形成的異二聚體跨膜糖蛋白，2 個亞基不同的組合形成了20多種整合素。其中，整合素αVβ3是一個經(jīng)典的靶向成像和治療的結(jié)合位點，可以與RGD肽特異性結(jié)合，近年來受到國內(nèi)外極大的關(guān)注。大量研究已證明整合素αVβ3在腫瘤新生血管［9］、脈絡膜新生血管［10］、傷口新生血管［11］中呈高表達。也有研究將其配體RGD 肽結(jié)合其他材料用于種植體引導牙周骨再生［12］、生物活性材料促進骨折愈合［13］等領(lǐng)域，取得了明顯的效果。本研究HE染色結(jié)果顯示，實驗組損傷達真皮層，并有大量炎細胞浸潤，達到了2期壓力性損傷程度。免疫組化染色顯示整合素αVβ3在新生的毛細血管內(nèi)皮細胞和上皮細胞中高表達，說明整合素αVβ3參與了2期壓力性損傷的形成。Ichioka等［14］的研究也證明了整合素αVβ3抑制劑能夠減少大鼠皮膚缺血再灌注損傷中白細胞和血管內(nèi)皮細胞的相互作用［14］。本研究中對照組整合素αVβ3表達陰性，說明在靜止或成熟血管內(nèi)皮細胞表面整合素αVβ3呈極低水平表達或無表達，但在壓力性損傷中表達顯著上升，這與壓力性損傷過程中涉及創(chuàng)傷、炎癥、缺血、缺氧、血管重塑、細胞增殖等病理過程有關(guān)。若以整合素αVβ3作為靶向結(jié)合位點，將RGD肽連接于空白造影劑，即可制備RGD 靶向超聲造影劑，從而使造影劑向整合素αVβ3表達的部位黏附聚集，增強創(chuàng)面顯影效果。

Fig.2 Comparison of HE staining of rat skin between the control group and the experimental group圖2 對照組和實驗組大鼠皮膚HE染色比較

Fig.3 Comparison of immunohistochemical staining of rat skin between the control group and the experimental group圖3 對照組和實驗組大鼠皮膚免疫組化染色對比

Fig.4 Pre-and post-cavitation images of two kinds of nano-bubble in experimental group圖4 實驗組大鼠兩種納米泡空化前后圖像

Tab.2 Comparison of targeted adhesion value(ΔI)between two kinds of nano-bubble in experimental group表2 實驗組大鼠2種納米泡空化前后靶向黏附值（ΔI）比較（n=18，dB，±s）

Tab.2 Comparison of targeted adhesion value(ΔI)between two kinds of nano-bubble in experimental group表2 實驗組大鼠2種納米泡空化前后靶向黏附值（ΔI）比較（n=18，dB，±s）

＊＊P＜0.01

組別空白納米泡RGD靶向納米泡t空化前11.96±1.45 15.86±1.83空化后10.92±1.35 9.90±1.74 ΔI 1.05±0.48 5.96±1.31 14.96＊＊

超聲造影劑是一種磷脂包裹惰性氣體形成的微泡或納米泡，是一種良好的血池顯影劑，皮膚微小血管在超聲探頭適當聲波下也可顯影。同時，也可控制超聲探頭瞬間釋放出高能量的超聲波，局部納米泡在機械能和熱能的作用下爆破，失去顯影功能，稱為超聲空化作用。本研究成功制備了靶向整合素αVβ3的RGD 靶向造影劑，并通過超聲空化的原理，驗證了其靶向性。當RGD靶向造影劑注入靜脈后，除了血管中流動的納米泡，還有少量與血管內(nèi)皮細胞表面整合素αVβ3靶向結(jié)合的納米泡。空化前RGD 納米泡已完成蓄積及靶向黏附，此時血池中顯影的為游離納米泡與RGD靶向納米泡。而空化后，所有納米泡均被擊破失去顯影，而血液循環(huán)帶來新的納米泡在2～3 s 后重新灌注，再次顯影，但尚未靶向黏附于血管內(nèi)皮細胞，故空化后重新顯影的為血池中游離納米泡。因此，納米泡空化前后增強強度的差值，即靶向黏附值，可用于衡量納米泡靶向黏附的效果。本研究中RGD 靶向納米泡靶向黏附值明顯高于空白納米泡，證明RGD靶向納米泡大大提高了局部造影劑的濃度，明顯增強了顯影效果，即RGD靶向納米泡在大鼠2期壓力性損傷中具有靶向性，這與損傷局部表達整合素αVβ3有關(guān)。既往有學者將RGD靶向阻斷劑用于大鼠切口疝［15］、將整合素αVβ3抗體用于下肢靜脈潰瘍患者［16］，將RGD嵌合纖連蛋白用于小鼠慢性傷口［17］，發(fā)現(xiàn)均有加速愈合的效果。因此，本實驗為下一步使用RGD靶向造影劑評估壓力性損傷和遞送促愈合藥物奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究證明了整合素αVβ3在大鼠2期壓力性損傷模型中呈高表達，同時驗證了RGD靶向超聲造影劑在2 期壓力性損傷中良好的靶向效果，有助于為壓力性損傷的分期和深度判斷提供客觀依據(jù)。后期有可能在RGD 靶向超聲造影劑基礎(chǔ)上攜載促愈合藥物，進而實現(xiàn)壓力性損傷的靶向治療。但整合素αVβ3表達的時間規(guī)律和RGD 靶向超聲造影劑在其他分期壓力性損傷中的評估效果有待進一步研究。