司志龍，李運(yùn)奇，胡波，桂華偉，肖飛

目前，術(shù)前新輔助放化療聯(lián)合全直腸系膜切除術(shù)（TME）已成為局部進(jìn)展期直腸癌患者治療的金標(biāo)準(zhǔn)。新輔助放化療的優(yōu)點(diǎn)在于縮小腫瘤、降低分期、提高手術(shù)切除率或保肛率。但新輔助放化療后仍有一部分分化差的腫瘤因其本身對(duì)放化療并不敏感，術(shù)前治療只是延誤了手術(shù)時(shí)間，放化療期間腫瘤仍在進(jìn)展［1］。因此，尋找對(duì)新輔助治療效果有預(yù)測價(jià)值的生物標(biāo)志物是直腸癌新輔助治療領(lǐng)域迫切需要解決的問題之一。有研究顯示，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α［2］和凋亡抑制蛋白生存素（Survivin）［3-4］可以通過多種途徑降低結(jié)直腸癌對(duì)放化療的敏感性。本研究旨在探討HIF-1α、Survivin 在直腸癌組織中的表達(dá)及對(duì)直腸癌新輔助放化療后腫瘤退縮效果的預(yù)測價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析我院2014 年4 月—2018 年8 月收治的直腸癌患者83例，所有患者術(shù)前均行新輔助放化療，治療結(jié)束后行TME。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前病理證實(shí)為腺癌，腫瘤距肛門＜12 cm。（2）根據(jù)2017年第8版美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)，分期屬于Ⅱ～Ⅲ期。（3）通過查詢患者歷次住院資料可以獲得完整的臨床病理信息。（4）患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前接受免疫治療和（或）分子靶向治療。（2）合并其他惡性腫瘤。83例中男51例，女32 例，年齡36～81 歲，平均年齡（62.8±9.2）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 新輔助放化療及手術(shù)方案 新輔助放化療中，患者接受總劑量50.0 Gy 的長程放療，每周5 次，每次2.0 Gy，共25 次；在長程放療期間同步進(jìn)行化療，化療方案選用卡培他濱單藥或持續(xù)灌注5-氟尿嘧啶（5-FU）或5-氟尿嘧啶/亞葉酸鈣（5-FU/LV），治療結(jié)束后均于6～10周內(nèi)行TME治療，手術(shù)方式包括低位前切除術(shù)（LAR）、腹會(huì)陰聯(lián)合直腸切除術(shù)（APR）和經(jīng)括約肌間切除術(shù)（ISR），所有患者均為R0切除。

1.3 腫瘤退縮評(píng)價(jià) 參考美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)評(píng)分系統(tǒng)（AJCC-TRG），依據(jù)腫瘤退縮分級(jí)評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)。0級(jí)（完全退縮）：無腫瘤細(xì)胞殘留；1級(jí)（中等退縮）：單個(gè)或者小灶腫瘤細(xì)胞殘留；2級(jí)（輕微退縮）：腫瘤殘留、間質(zhì)見大量纖維化；3級(jí)（無退縮）：廣泛腫瘤殘留、無或少量腫瘤細(xì)胞壞死。0～1級(jí)定義為退縮有效，2～3級(jí)定義為退縮無效。

1.4 免疫組化及結(jié)果判定 收集本研究組患者的術(shù)前活檢標(biāo)本，檢測標(biāo)本中HIF-1α 和Survivin 的表達(dá)。鼠抗人HIF-1α抗體購自武漢博士德公司，兔抗人Survivin 抗體購自美國Santa Cruz 公司，其余所用試劑購自北京中杉金橋生物有限公司。采用免疫組化SP 法，參照試劑盒說明檢測兩者的表達(dá)。染色結(jié)果判定由病理科專科醫(yī)生獨(dú)立閱片，根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色的陽性強(qiáng)度和陽性細(xì)胞的占比進(jìn)行綜合評(píng)定。染色強(qiáng)度計(jì)分：染色與陰性對(duì)照相同者計(jì)0分，染色呈淡黃色者計(jì)1 分，棕黃色者計(jì)2 分，褐色者計(jì)3 分；陽性范圍計(jì)分：0%～25%計(jì)1 分，26%～50%計(jì)2 分，51%～75%計(jì)3 分，76%～100%計(jì)4分。將上述兩項(xiàng)計(jì)分相加分級(jí)，1～2分為（-），3分為（±），4～5分為（+），6～7分為（++），定義≥4分為陽性表達(dá)，＜4分為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤退縮情況及手術(shù)標(biāo)本的病理改變 直腸癌新輔助治療后，腫瘤退縮總有效率為55.4%（46/83），完全退縮者13 例，中等退縮者33 例，輕微退縮者20 例，無退縮者17 例，完全緩解者的大體標(biāo)本如圖1A 箭頭所示，可見腫瘤完全退縮形成瘢痕，鏡下可見纖維組織增生、大量炎癥細(xì)胞浸潤，見圖1B。

Fig.1 Gross specimen and microscopic appearance of completely alleviated patients(HE staining,×400)圖1 完全緩解者的大體標(biāo)本和鏡下所見（HE染色，×400）

2.2 直腸癌組織中HIF-1α 和Survivin 的表達(dá)情況 HIF-1α 和Survivin 在直腸癌組織中均呈高表達(dá)，陽性表達(dá)率分別是61.4%（51/83）、67.5%（56/83），HIF-1α 表現(xiàn)為程度不等的細(xì)胞質(zhì)染色，Survivin 為細(xì)胞核染色，呈黃色或褐色顆粒，見圖2。Spearman 等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)顯示直腸癌組織中HIF-1α和Survivin 的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.587，P＜0.01），見表1。

Fig.2 Positive expressions of HIF-1α and Survivin in rectal cancer tissues(SP,×200)圖2 直腸癌組織中HIF-1α和Survivin的陽性表達(dá)（SP，×200）

2.3 HIF-1α 和Survivin 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)患者治療前的影像學(xué)檢查進(jìn)行臨床分期，不同腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)分組患者HIF-1α、Survivin 陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同年齡、性別、腫瘤浸潤深度分組，患者HIF-1α、Survivin 陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Tab.1 Relationship between expressions of HIF-1α and Survivin表1 HIF-1α和Survivin表達(dá)的關(guān)系

Tab.2 Relationship between expressions of HIF-1α and Survivin and clinicopathologic features表2 HIF-1α和Survivin的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 HIF-1α 和Survivin 的表達(dá)與新輔助放化療后腫瘤退縮效果之間的關(guān)系 HIF-1α 陽性表達(dá)者腫瘤退縮有效率低于陰性表達(dá)者，Survivin陽性表達(dá)者腫瘤退縮有效率顯著低于陰性表達(dá)者（均P＜0.05），見表3。

2.5 HIF-1α 和Survivin 的聯(lián)合表達(dá)與新輔助放化療后腫瘤退縮之間的關(guān)系 根據(jù)直腸癌組織中HIF-1α 和Survivin 的表達(dá)情況，將上述患者分為4組，4 組患者中腫瘤退縮有效率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，HIF-1α 和Survivin 同時(shí)陽性者放化療有效率明顯低于其他組別，見表4。

3 討論

新輔助放化療是局部進(jìn)展期直腸癌治療的標(biāo)準(zhǔn)方式，但仍有部分患者的治療效果不夠理想。近年來，腫瘤分子標(biāo)志物在放化療中的預(yù)測價(jià)值成為研究熱點(diǎn)，但直腸癌新輔助放化療分子靶標(biāo)的報(bào)道并不多，對(duì)治療效果的預(yù)測價(jià)值也不確切。如果能在新輔助放化療前通過檢測某些生物標(biāo)志物篩選出對(duì)其應(yīng)答不敏感的患者，可避免不必要的術(shù)前治療。

Tab.3 Relationship between expressions of HIF-1α and Survivin and tumor regression after neoadjuvant chemoradiotherapy表3 HIF-1α和Survivin的表達(dá)與新輔助放化療后腫瘤退縮效果之間的關(guān)系

Tab.4 Relationship between combined expressions of HIF-1α and Survivin and tumor regression after neoadjuvant chemoradiotherapy表4 HIF-1α和Survivin的聯(lián)合表達(dá)與新輔助放化療后腫瘤退縮之間的關(guān)系

有研究表明，HIF-1α 參與腫瘤多種信號(hào)通路，調(diào)控腫瘤血管生成、控制細(xì)胞增殖和能量代謝、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，為放療下存在的乏氧腫瘤細(xì)胞提供能量，從而降低了腫瘤細(xì)胞的放療敏感性［5-7］。最新的研究顯示，HIF-1α的表達(dá)上調(diào)可以降低結(jié)直腸癌對(duì)放療的敏感性［2］，促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［8-9］。Survivin 屬于凋亡抑制蛋白家族的成員，是目前為止作用最強(qiáng)的凋亡抑制分子，在幾乎所有腫瘤組織中高表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)、增殖、自噬、凋亡等多個(gè)過程［10］，還參與了腫瘤的多藥耐藥過程，是腫瘤耐藥的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子。最近的研究顯示，Survivin表達(dá)上調(diào)降低了結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性［3-4］，Survivin 可能參與了結(jié)直腸癌中腫瘤的進(jìn)展［11］，并能夠促進(jìn)其浸潤和轉(zhuǎn)移［12］。但是，對(duì)于直腸癌中HIF-1α和Survivin的聯(lián)合檢測以及兩者對(duì)直腸癌新輔助放化療后腫瘤退縮的預(yù)測價(jià)值少有報(bào)道。

本研究選取行新輔助放化療的局部進(jìn)展期直腸癌患者的術(shù)前活檢組織，重新檢測組織中HIF-1α和Survivin的表達(dá)，并結(jié)合其臨床病理資料進(jìn)行了回顧性分析，初步探討兩者對(duì)局部進(jìn)展期直腸癌新輔助放化療后腫瘤退縮效果的預(yù)測價(jià)值。本研究顯示不同腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)患者，HIF-1α 陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Novell 等［13］的研究結(jié)果一致；Survivin 陽性表達(dá)在不同腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Wang等［14］的研究結(jié)果一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)HIF-1α（+）/Survivin（+）組的腫瘤退縮有效率明顯低于其他組別，提示兩者的表達(dá)狀態(tài)對(duì)腫瘤的退縮有不同影響，本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)HIF-1α和Survivin的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)，推測HIF-1α 直接誘導(dǎo)或者間接影響Survivin在直腸癌中的表達(dá)，且兩者在腫瘤抗凋亡過程中具有協(xié)同作用。有研究表明，HIF-1α可以誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)上游分子白介素-6 的表達(dá)，從而活化STAT3 通路［15］。STAT3信號(hào)通路的持續(xù)激活又可以通過調(diào)節(jié)下游相關(guān)靶基因的表達(dá)，主要包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、Survivin、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）、c-Myc、B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、細(xì)胞凋亡抑制蛋白2（cIAP2）、髓樣細(xì)胞白血病-1（Mcl-1）等，促進(jìn)血管生成、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［16］。鑒于此，推測Survivin 的上游激活區(qū)有HIF-1α 的結(jié)合位點(diǎn)，即HIF-1α 可能通過STAT3 上調(diào)Survivin 的表達(dá)，促成了兩者在直腸癌抗凋亡過程中的協(xié)同作用，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

HIF-1α和Survivin的表達(dá)情況對(duì)進(jìn)展期直腸癌新輔助治療后腫瘤退縮的效果預(yù)測提供了一定的臨床證據(jù)，通過靶點(diǎn)HIF-1α 和Survivin 可能會(huì)是增強(qiáng)直腸癌新輔助放化療有效性的抗腫瘤策略，但鑒于本研究為回顧性研究以及選取的病例數(shù)量有限，更明確的預(yù)測價(jià)值需要多中心、大樣本的研究來證實(shí)。同時(shí)，由于腫瘤的增殖與凋亡、對(duì)放療的敏感性和對(duì)化療藥物的耐藥性、侵襲與轉(zhuǎn)移等是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，不可能僅限于一兩個(gè)細(xì)胞因子，更不會(huì)只取決于某條信號(hào)通路，所以還有很多問題尚待解決。