劉磊,王長(zhǎng)麗,葛菁萍
黑龍江大學(xué)a. 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心,黑龍江 哈爾濱150500;b. 生命科學(xué)學(xué)院微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱150080
2,3-丁二醇(2,3-butanediol;2,3-BD)及其衍生物是重要的平臺(tái)化合物,在化工、燃料、食品等領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。自然界中具有較強(qiáng)2,3-BD 生產(chǎn)能力的微生物大多為條件致病菌,如克雷伯菌屬與腸桿菌屬,大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)2,3-BD 會(huì)受到限制[3]。與這些條件致病菌相比,釀酒酵母作為公認(rèn)安全(generally recognized as safe,GRAS)微生物,被廣泛用于各種化學(xué)品和燃料的工業(yè)化生產(chǎn)中[4-5]。釀酒酵母是真核模式生物,其遺傳背景清晰,研究較為透徹。雖然野生型釀酒酵母產(chǎn)2,3-BD 的量較少,但可以利用基因工程方法對(duì)其進(jìn)行改造[6]。釀酒酵母發(fā)酵的主產(chǎn)物是乙醇,故在其代謝途徑中,丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylases,PDC)至關(guān)重要。PDC是一種非氧化酶,位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中,可以催化丙酮酸脫羧,首先生成乙醛和CO2,乙醛在相關(guān)酶的催化下進(jìn)一步生成乙酸和乙醇[7]。因此,可以通過(guò)構(gòu)建含有敲除組件的質(zhì)粒,敲除釀酒酵母中丙酮酸脫羧酶的編碼基因(pdc1、pdc5和pdc6)來(lái)阻斷部分副產(chǎn)物生成,以提高2,3-BD 的產(chǎn)量[8-9]。
基因敲除技術(shù)普遍應(yīng)用于微生物代謝工程及菌種改造等領(lǐng)域,其中Cre-loxP 重組酶技術(shù)可以特異性控制Cre 重組酶在特定組織的表達(dá),以實(shí)現(xiàn)在特定組織細(xì)胞中對(duì)目的基因的敲除或改造[10]。Cre-loxP 重組酶技術(shù)系統(tǒng)由Cre 重組酶與特異性靶位點(diǎn)loxP 組成。Cre 重組酶是位點(diǎn)特異性重組酶,通過(guò)識(shí)別特異的DNA 序列(loxP 位點(diǎn)),可以敲除loxP 位點(diǎn)間的基因序列[11],同時(shí)又能敲除標(biāo)記基因kanMX,有效解決了在同一株釀酒酵母細(xì)胞中進(jìn)行多基因敲除時(shí)抗性篩選標(biāo)記選擇的難題[12]。應(yīng)用Cre-loxP 重組酶技術(shù),首先需要選取pUG 系列質(zhì)粒,因其上2 個(gè)loxP 位點(diǎn)中含有篩選標(biāo)記基因(如loxP-kanMX-loxP),同時(shí)需要構(gòu)建基因敲除組件,使loxP-kanMX-loxP兩端含有40~45 bp 敲除基因的同源片段,并將其導(dǎo)入受體細(xì)胞,即可實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除,若向其中導(dǎo)入pSH 系列質(zhì)粒(可表達(dá)Cre 重組酶),又能將標(biāo)記基因消除[13-14]。
我們以質(zhì)粒pUG6 基因組DNA 為模板,克隆出兩端含40 bp 與釀酒酵母pdc1、pdc5同源的線性片段pdc1-loxP-kanMX(1693 bp)和pdc5-loxP-kanMX(1672 bp),以遺傳霉素G418 為抗性篩選標(biāo)記,構(gòu)建含有pdc1、pdc5同源序列l(wèi)oxP-kanMX-loxP的質(zhì)粒,將構(gòu)建后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母H5 進(jìn)行篩選及鑒定,并通過(guò)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)測(cè)定菌株發(fā)酵產(chǎn)量變化情況。本研究分別敲除了釀酒酵母體內(nèi)丙酮酸脫羧酶基因pdc1、pdc5,為進(jìn)一步連續(xù)敲除pdc1、pdc5奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
釀酒酵母H5 和大腸桿菌DH5α由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;質(zhì)粒pMD18-T 購(gòu)自大連寶生物工程有限公司,pEASY-T3 購(gòu)自北京全式金有限公司,pUG6 由廣西大學(xué)杜麗琴教授饋贈(zèng);限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ購(gòu)自北京天璽瑞至有限公司;PfuDNA 聚合酶、TaqDNA 聚合酶購(gòu)自TaKaRa 公司;TIANgel Midi Purification Kit 普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司;BioSpin Gel Extraction Kit 購(gòu)自杭州博日科技有限公司。
發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖80 g/L、蛋白胨20 g/L、YNB 3.4 g/L、KH2PO43.4 g/L、K2HPO43 g/L、(NH4)2SO410 g/L,108℃滅菌20 min;LB 培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、酵母浸出物5 g/L,121℃滅菌15 min;YPD 培養(yǎng)基:酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L,108℃滅菌20 min。
依據(jù)NCBI 中釀酒酵母S288C(序列號(hào):NC_001144.5)的pdc1、pdc5和pUG6 質(zhì)粒序列(序列號(hào):AF298793.1)設(shè)計(jì)引物對(duì)pdc1-S1 和pdc1-S2、pdc5-S1 和pdc5-S2(表1),用來(lái)擴(kuò)增pdc1、pdc5。引物兩端各40 bppdc1、pdc5同源序列(下劃線部分),其他20 bp 用于擴(kuò)增loxP-kanMX-loxP。
表1 引物序列
圖1 轉(zhuǎn)化子的PCR 驗(yàn)證示意圖
將復(fù)蘇后含有pUG6 的大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)接到氨芐青霉素終濃度為100 μg/mL 的LB 液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,提取質(zhì)粒DNA,以獲得的pUG6 質(zhì) 粒DNA為模板,pdc1-S1 和pdc1-S2、pdc5-S1 和pdc5-S2 為引物,PCR 擴(kuò)增目的片段(反應(yīng)程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s,56℃30 s,72℃4 min,35 個(gè)循環(huán);72℃10 min)。
PCR 結(jié)束后,向反應(yīng)體系中加入0.25 μLTaqDNA 聚合酶(5 U/μL),進(jìn)行加“A”尾,72℃水浴中反應(yīng)10 min,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物;用BioSpin Gel Extraction Kit 純化目的片段,并在16℃金屬浴中與pMD18-T 載體過(guò)夜連接;將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,適當(dāng)稀釋涂布培養(yǎng)至LB 培養(yǎng)基中;隨機(jī)挑取LB 培養(yǎng)基中的白色單菌落,接種于含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中,37℃、160 r/min 振蕩過(guò)夜培養(yǎng),PCR 驗(yàn)證大腸桿菌轉(zhuǎn)化子;提取重組克隆質(zhì)粒,BamHⅠ單酶切驗(yàn)證陽(yáng)性質(zhì)粒,送上海生工生物工程有限公司測(cè)序,用生物學(xué)軟件分析比對(duì)測(cè)序結(jié)果,驗(yàn)證正確含有目的序列的克隆質(zhì)粒命名為pTWCL-PDC1 與pTWCL-PDC5,同源重組片段命名為pdc1-loxP-kanMX與pdc5-loxP-kanMX。將驗(yàn)證正確的克隆質(zhì)粒用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母H5。
片 段pdc1-loxP-kanMX與pdc5-loxP-kanMX分別轉(zhuǎn)化菌株釀酒酵母H5 后,設(shè)計(jì)引物pdc1-A1、pdc1-B1、pdc1-C1、pdc1-D1 與pdc5-A5、pdc5-B1、pdc5-C1、pdc5-D5 進(jìn) 行PCR 驗(yàn) 證,隨機(jī)挑取在YPD+G418 平板上生長(zhǎng)的單菌落,提取基因組DNA,以基因組DNA 為模板,用引物對(duì)pdc1-B1 和pdc1-C1、pdc1-A1 和pdc1-B1、pdc1-A1 和pdc1-D1、pdc1-C1 和pdc1-D1分別對(duì)pdc1-loxP-kanMX進(jìn)行PCR 驗(yàn)證(圖1A),用引物對(duì)pdc5-B1 和pdc5-C1、pdc5-A5 和pdc5-D5 分 別對(duì)pdc5-loxP-kanMX進(jìn)行PCR 驗(yàn)證(圖1B)。
pSH69 質(zhì)粒自身帶有潮霉素(HyB)標(biāo)記基因,添加半乳糖可誘導(dǎo)表達(dá)Cre 重組酶消除其G418 抗性。用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pSH69 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化重組菌株,將驗(yàn)證成功的轉(zhuǎn)化子接種于液體YPD中,過(guò)夜培養(yǎng)后添加終濃度為1%的半乳糖溶液誘導(dǎo)表達(dá)Cre 重組酶,繼續(xù)培養(yǎng)至菌液D600nm約為1.3,稀釋涂布于YPD 與YPD+G418 平板上,挑取在YPD+G418 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)受抑制而在YPD 平板上長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落,以基因組DNA 為模板,用引物對(duì)pdc1-A1 和pdc1-D1、pdc1-B1 和pdc1-C1 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證抗性片段kanMX是否敲除成功。之后將添加pSH69 質(zhì)粒的重組菌株涂布于YPD+HyB 平板上培養(yǎng)2~3 d,挑取平板上的單菌落,用滅菌槍頭將其分別點(diǎn)殖于YPD+HyB 和YPD 平板上,通過(guò)連續(xù)傳代獲得失去HyB 抗性的單菌落。將質(zhì)粒丟失且pdc1、pdc5分別敲除的菌株命名為H5-01 和H5-02。
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的釀酒酵母H5、H5-01、H5-02 菌株分別以5%的接種量接種于150 mL/500 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30℃、150 r/min 發(fā)酵72 h,每 隔12h取樣測(cè) 定D600nm和pH 值,通 過(guò)HPLC 檢測(cè)發(fā)酵液中乙醇和2,3-BD 濃度的變化。
圖2 PCR 擴(kuò) 增loxP-kanMX-loxP 片段
圖3 陽(yáng)性克隆子的菌液PCR 驗(yàn)證
PCR 驗(yàn)證含有質(zhì)粒pTWCL-PDC1 與pTWCLPDC5 的陽(yáng)性克隆子,從圖2A 可以看出,PCR 產(chǎn)物pdc1-loxP-kanMX片段與目的片段大小相同,為1693 bp,與預(yù)期結(jié)果相符;從圖2B 可以看出,PCR 產(chǎn)物pdc5-loxP-kanMX(1672 bp)片段與預(yù)期片段大小相符。
片段pdc1-loxp-kanMX、pdc5-loxP-kanMX純化后分別連接到克隆載體pMD18-T、pEASY-T3 上,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,從每種轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取17 個(gè)白色菌落進(jìn)行菌液PCR 鑒定。圖3A 中泳道1、3、5、7、15、17 號(hào)陽(yáng)性克隆子擴(kuò)增得到的片段均與pdc1-loxP-kanMX大小相符(1693 bp),圖3B 中泳道1、2、3、4、5、12 號(hào)陽(yáng)性克隆子擴(kuò)增得到的片段均與pdc5-loxP-kanMX片段大小相符(1672 bp),說(shuō)明目的基因pdc1-loxP-kanMX與質(zhì)粒pMD18-T連接成功,pdc5-loxP-kanMX與質(zhì)粒pEASY-T3 連接成功。從轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒pMD18-T、pEASY-T3 中選取陽(yáng)性克隆子提取質(zhì)粒,分別經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ單酶切驗(yàn)證,將目的片段測(cè)序后與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),發(fā)現(xiàn)pdc1-loxP-kanMX、pdc5-loxP-kanMX核苷酸序列與NCBI 中公開(kāi)的基因序列相似度達(dá)100%,未發(fā)生堿基突變。
pdc1、pdc5基因敲除轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證分別見(jiàn)圖4、5,在B1-C1(732 bp)、A1-B1(1202 bp)、A1-D1(1732 bp)、C1-D1(1066 bp)與A5-D5(1185 bp)、B1-C1(732 bp)處均有清晰條帶出現(xiàn),與預(yù)期片段大小相符。
圖4 用引物B1-C1(A)、A1-B1(B)、A1-D1(C)、C1-D1(D)的PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證
圖5 用引物A5-D5(A)、B1-C1(B)的PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證
用引物pdc1-A1 和pdc1-D1、pdc1-B1 和pdc1-C1 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,驗(yàn)證抗性片段kanMX的結(jié)果如圖6,在A1-D1(262 bp)處有清晰條帶出現(xiàn),而B(niǎo)1-C1(732 bp)處未擴(kuò)增出條帶,說(shuō)明kanMX片段已消除,并敲除了pdc1、pdc5。
圖6 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證kanMX、pdc1、pdc5 基因
圖7 工程菌株的發(fā)酵變化曲線
圖7A 所示,菌株H5/H5-01/H5-02 發(fā)酵12 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,36 h 達(dá)到穩(wěn)定期,但重組菌株H5-01 和H5-02 的長(zhǎng)勢(shì)略低于H5,D600nm值較原始菌株分別降低了16.89%、13.80%。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是敲除pdc1和pdc5后不同程度影響了菌株生長(zhǎng)及體內(nèi)的酸堿平衡,進(jìn)而使菌株生長(zhǎng)呈現(xiàn)緩慢趨勢(shì)。在0~12 h 時(shí)pH 值總體呈上升趨勢(shì),但24 h 后重組菌株的pH 值高于原始菌株,可能是重組菌株的丙酮酸脫羧酶基因被破壞,導(dǎo)致其乙酸產(chǎn)量降低,使其pH 值略高。圖7B 所示,經(jīng)HPLC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組菌株乙醇產(chǎn)量明顯低于原始菌株,H5-01、H5-02 的最高乙醇產(chǎn)量分別為35.946±0.918、34.680±0.887 g/L,較原始菌株H5 乙醇產(chǎn)量(42.056±0.880 g/L)分別下降了14.53%與17.54%。此外,重組菌株的2,3-BD 積累量明顯高于原始菌株,最高產(chǎn)量為0.264±0.015 g/L。由此可見(jiàn),含有pdc1、pdc5同源序列線性片段的敲除質(zhì)粒pTWCL-PDC1 與pTWCL-PDC5 構(gòu) 建成功,導(dǎo)致重組菌株的丙酮酸脫羧酶活性降低,乙醇產(chǎn)量明顯下降,并且流向乙醇的部分碳源流向了2,3-BD 的生成方向,使其2,3-BD 產(chǎn)量得到提高。
作為一種單細(xì)胞真核生物,釀酒酵母易于培養(yǎng),其遺傳操作技術(shù)成熟,相關(guān)理論研究較為清楚,可以利用基因工程手段對(duì)釀酒酵母進(jìn)行更加準(zhǔn)確的改造[15-16]。其中,利用Cre-loxP 重組酶技術(shù)可以準(zhǔn)確、高效地敲除靶基因,而且標(biāo)記基因也可以被選擇性切除。林曉華等[17]擴(kuò)增帶有kanr篩選標(biāo)記的SNF4基因敲除組件,轉(zhuǎn)化釀酒酵母,利用Cre-LoxP 重組酶技術(shù)切除kanr篩選標(biāo)記并獲得SNF4等位基因完全缺失菌株。Semkiv 等[18]從大腸桿菌中克隆獲得kanMX4,將該基因與報(bào)告基因PHO8(編碼堿性磷酸酶)相連,構(gòu)建多拷貝數(shù)的整合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化釀酒酵母,使其具有更高的抗生素抗性。本研究通過(guò)PCR 克隆得到pdc1-loxP-kanMX基因片段,采用同源重組原理構(gòu)建表達(dá)載體,該載體含有基因敲除組件與篩選標(biāo)記基因(loxP-kanMX-loxP),在一定程度上可作為敲除釀酒酵母相關(guān)基因的技術(shù)參考。
丙酮酸是糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物,連接許多代謝途徑,PDC 是釀酒酵母代謝途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶,其活性主要由pdc1、pdc5和pdc6這3個(gè)基因控制,可以使丙酮酸生成乙醛,然后通過(guò)醛醇縮合反應(yīng)合成少量的乙偶姻,并進(jìn)一步生成2,3-BD[19-20]。我們構(gòu)建了含有pdc1、pdc5同源序列線性片段的敲除質(zhì)粒pTWCL-PDC1 與pTWCLPDC5,并將其分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母H5,通過(guò)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組菌株的乙醇產(chǎn)量較原始菌株明顯下降,而2,3-BD 產(chǎn)量明顯上升,表明構(gòu)建后的質(zhì)粒對(duì)釀酒酵母的PDC 活性產(chǎn)生了影響。丙酮酸在PDC 作用下生成乙醛,乙醛又能生成乙醇[21],質(zhì)粒pTWCL-PDC1 與pTWCL-PDC5 使釀酒酵母H5 的pdc1、pdc5基因被分別敲除,菌株的丙酮酸脫羧酶活性減弱,中間產(chǎn)物丙酮酸大量積累,減少了乙醇的產(chǎn)生,使碳源更多流向2,3-BD 產(chǎn)生途徑。吳滿珍等[22]構(gòu)建含有pdc1和adh1同源序列的質(zhì)粒,將其導(dǎo)入釀酒酵母CEN.PK2-1C,重組菌株的最高乙醇產(chǎn)量較野生菌株下降了63.8%,而丙酮酸達(dá)到2.0 g/L。Lian 等[23]構(gòu)建了質(zhì)粒pRS426,通過(guò)同源重組方法使野生型釀酒酵母體內(nèi)同時(shí)缺失pdc1、pdc5、pdc6基因,并過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子MTH1,利用葡萄糖和半乳糖作為底物,通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵,其2,3-BD 產(chǎn)量提高到100 g/L。
綜上,我們依據(jù)NCBI 獲得pdc1、pdc5基因左右兩端各40 bp 同源序列,以pUG6 質(zhì)粒DNA 為模板設(shè)計(jì)引物,PCR 分別擴(kuò)增兩端各含40 bppdc1、pdc5同源序列的基因敲除片段pdc1-loxP-kanMX、pdc5-loxP-kanMX,分別插入質(zhì)粒pMD18-T、pEASY-T3,得到重組表達(dá)載體pTWCL-PDC1與pTWCL-PDC5,并將其分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母H5,搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組菌株乙醇產(chǎn)量明顯下降,PDC 活性降低。研究結(jié)果表明,含有釀酒酵母pdc1、pdc5同源序列的loxP-kanMX-loxP質(zhì)粒構(gòu)建成功,釀酒酵母中的pdc1、pdc5基因被成功敲除。