劉磊，王長(zhǎng)麗，葛菁萍

黑龍江大學(xué)a. 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱150500；b. 生命科學(xué)學(xué)院微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150080

2，3-丁二醇（2，3-butanediol；2，3-BD）及其衍生物是重要的平臺(tái)化合物，在化工、燃料、食品等領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。自然界中具有較強(qiáng)2，3-BD 生產(chǎn)能力的微生物大多為條件致病菌，如克雷伯菌屬與腸桿菌屬，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)2，3-BD 會(huì)受到限制[3]。與這些條件致病菌相比，釀酒酵母作為公認(rèn)安全（generally recognized as safe，GRAS）微生物，被廣泛用于各種化學(xué)品和燃料的工業(yè)化生產(chǎn)中[4-5]。釀酒酵母是真核模式生物，其遺傳背景清晰，研究較為透徹。雖然野生型釀酒酵母產(chǎn)2，3-BD 的量較少，但可以利用基因工程方法對(duì)其進(jìn)行改造[6]。釀酒酵母發(fā)酵的主產(chǎn)物是乙醇，故在其代謝途徑中，丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylases，PDC）至關(guān)重要。PDC是一種非氧化酶，位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，可以催化丙酮酸脫羧，首先生成乙醛和CO2，乙醛在相關(guān)酶的催化下進(jìn)一步生成乙酸和乙醇[7]。因此，可以通過(guò)構(gòu)建含有敲除組件的質(zhì)粒，敲除釀酒酵母中丙酮酸脫羧酶的編碼基因（pdc1、pdc5和pdc6）來(lái)阻斷部分副產(chǎn)物生成，以提高2，3-BD 的產(chǎn)量[8-9]。

基因敲除技術(shù)普遍應(yīng)用于微生物代謝工程及菌種改造等領(lǐng)域，其中Cre-loxP 重組酶技術(shù)可以特異性控制Cre 重組酶在特定組織的表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)在特定組織細(xì)胞中對(duì)目的基因的敲除或改造[10]。Cre-loxP 重組酶技術(shù)系統(tǒng)由Cre 重組酶與特異性靶位點(diǎn)loxP 組成。Cre 重組酶是位點(diǎn)特異性重組酶，通過(guò)識(shí)別特異的DNA 序列（loxP 位點(diǎn)），可以敲除loxP 位點(diǎn)間的基因序列[11]，同時(shí)又能敲除標(biāo)記基因kanMX，有效解決了在同一株釀酒酵母細(xì)胞中進(jìn)行多基因敲除時(shí)抗性篩選標(biāo)記選擇的難題[12]。應(yīng)用Cre-loxP 重組酶技術(shù)，首先需要選取pUG 系列質(zhì)粒，因其上2 個(gè)loxP 位點(diǎn)中含有篩選標(biāo)記基因（如loxP-kanMX-loxP），同時(shí)需要構(gòu)建基因敲除組件，使loxP-kanMX-loxP兩端含有40～45 bp 敲除基因的同源片段，并將其導(dǎo)入受體細(xì)胞，即可實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除，若向其中導(dǎo)入pSH 系列質(zhì)粒（可表達(dá)Cre 重組酶），又能將標(biāo)記基因消除[13-14]。

我們以質(zhì)粒pUG6 基因組DNA 為模板，克隆出兩端含40 bp 與釀酒酵母pdc1、pdc5同源的線性片段pdc1-loxP-kanMX（1693 bp）和pdc5-loxP-kanMX（1672 bp），以遺傳霉素G418 為抗性篩選標(biāo)記，構(gòu)建含有pdc1、pdc5同源序列l(wèi)oxP-kanMX-loxP的質(zhì)粒，將構(gòu)建后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母H5 進(jìn)行篩選及鑒定，并通過(guò)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)測(cè)定菌株發(fā)酵產(chǎn)量變化情況。本研究分別敲除了釀酒酵母體內(nèi)丙酮酸脫羧酶基因pdc1、pdc5，為進(jìn)一步連續(xù)敲除pdc1、pdc5奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒酵母H5 和大腸桿菌DH5α由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；質(zhì)粒pMD18-T 購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，pEASY-T3 購(gòu)自北京全式金有限公司，pUG6 由廣西大學(xué)杜麗琴教授饋贈(zèng)；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ購(gòu)自北京天璽瑞至有限公司；PfuDNA 聚合酶、TaqDNA 聚合酶購(gòu)自TaKaRa 公司；TIANgel Midi Purification Kit 普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；BioSpin Gel Extraction Kit 購(gòu)自杭州博日科技有限公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖80 g/L、蛋白胨20 g/L、YNB 3.4 g/L、KH2PO43.4 g/L、K2HPO43 g/L、（NH4）2SO410 g/L，108℃滅菌20 min；LB 培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、酵母浸出物5 g/L，121℃滅菌15 min；YPD 培養(yǎng)基:酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，108℃滅菌20 min。

1.2 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)NCBI 中釀酒酵母S288C（序列號(hào):NC_001144.5）的pdc1、pdc5和pUG6 質(zhì)粒序列（序列號(hào):AF298793.1）設(shè)計(jì)引物對(duì)pdc1-S1 和pdc1-S2、pdc5-S1 和pdc5-S2（表1），用來(lái)擴(kuò)增pdc1、pdc5。引物兩端各40 bppdc1、pdc5同源序列（下劃線部分），其他20 bp 用于擴(kuò)增loxP-kanMX-loxP。

表1 引物序列

圖1 轉(zhuǎn)化子的PCR 驗(yàn)證示意圖

1.3 兩端各含40bppdc1、pdc5同源序列的loxP-kanMX-loxP片段的克隆及轉(zhuǎn)化

將復(fù)蘇后含有pUG6 的大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)接到氨芐青霉素終濃度為100 μg/mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，提取質(zhì)粒DNA，以獲得的pUG6 質(zhì) 粒DNA為模板，pdc1-S1 和pdc1-S2、pdc5-S1 和pdc5-S2 為引物，PCR 擴(kuò)增目的片段（反應(yīng)程序:94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃30 s，72℃4 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃10 min）。

PCR 結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入0.25 μLTaqDNA 聚合酶（5 U/μL），進(jìn)行加“A”尾，72℃水浴中反應(yīng)10 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物；用BioSpin Gel Extraction Kit 純化目的片段，并在16℃金屬浴中與pMD18-T 載體過(guò)夜連接；將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，適當(dāng)稀釋涂布培養(yǎng)至LB 培養(yǎng)基中；隨機(jī)挑取LB 培養(yǎng)基中的白色單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min 振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，PCR 驗(yàn)證大腸桿菌轉(zhuǎn)化子；提取重組克隆質(zhì)粒，BamHⅠ單酶切驗(yàn)證陽(yáng)性質(zhì)粒，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，用生物學(xué)軟件分析比對(duì)測(cè)序結(jié)果，驗(yàn)證正確含有目的序列的克隆質(zhì)粒命名為pTWCL-PDC1 與pTWCL-PDC5，同源重組片段命名為pdc1-loxP-kanMX與pdc5-loxP-kanMX。將驗(yàn)證正確的克隆質(zhì)粒用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母H5。

1.4 缺失菌株的篩選與鑒定

片 段pdc1-loxP-kanMX與pdc5-loxP-kanMX分別轉(zhuǎn)化菌株釀酒酵母H5 后，設(shè)計(jì)引物pdc1-A1、pdc1-B1、pdc1-C1、pdc1-D1 與pdc5-A5、pdc5-B1、pdc5-C1、pdc5-D5 進(jìn) 行PCR 驗(yàn) 證，隨機(jī)挑取在YPD+G418 平板上生長(zhǎng)的單菌落，提取基因組DNA，以基因組DNA 為模板，用引物對(duì)pdc1-B1 和pdc1-C1、pdc1-A1 和pdc1-B1、pdc1-A1 和pdc1-D1、pdc1-C1 和pdc1-D1分別對(duì)pdc1-loxP-kanMX進(jìn)行PCR 驗(yàn)證（圖1A），用引物對(duì)pdc5-B1 和pdc5-C1、pdc5-A5 和pdc5-D5 分 別對(duì)pdc5-loxP-kanMX進(jìn)行PCR 驗(yàn)證（圖1B）。

1.5 G418抗性的消除

pSH69 質(zhì)粒自身帶有潮霉素（HyB）標(biāo)記基因，添加半乳糖可誘導(dǎo)表達(dá)Cre 重組酶消除其G418 抗性。用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pSH69 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化重組菌株，將驗(yàn)證成功的轉(zhuǎn)化子接種于液體YPD中，過(guò)夜培養(yǎng)后添加終濃度為1%的半乳糖溶液誘導(dǎo)表達(dá)Cre 重組酶，繼續(xù)培養(yǎng)至菌液D600nm約為1.3，稀釋涂布于YPD 與YPD+G418 平板上，挑取在YPD+G418 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)受抑制而在YPD 平板上長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落，以基因組DNA 為模板，用引物對(duì)pdc1-A1 和pdc1-D1、pdc1-B1 和pdc1-C1 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證抗性片段kanMX是否敲除成功。之后將添加pSH69 質(zhì)粒的重組菌株涂布于YPD+HyB 平板上培養(yǎng)2～3 d，挑取平板上的單菌落，用滅菌槍頭將其分別點(diǎn)殖于YPD+HyB 和YPD 平板上，通過(guò)連續(xù)傳代獲得失去HyB 抗性的單菌落。將質(zhì)粒丟失且pdc1、pdc5分別敲除的菌株命名為H5-01 和H5-02。

1.6 發(fā)酵性能檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的釀酒酵母H5、H5-01、H5-02 菌株分別以5%的接種量接種于150 mL/500 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min 發(fā)酵72 h，每 隔12h取樣測(cè) 定D600nm和pH 值，通 過(guò)HPLC 檢測(cè)發(fā)酵液中乙醇和2，3-BD 濃度的變化。

2 結(jié)果

2.1 兩端各含40bppdc1、pdc5同源序列的loxP-kanMX-loxP片段的克隆

圖2 PCR 擴(kuò) 增loxP-kanMX-loxP 片段

圖3 陽(yáng)性克隆子的菌液PCR 驗(yàn)證

PCR 驗(yàn)證含有質(zhì)粒pTWCL-PDC1 與pTWCLPDC5 的陽(yáng)性克隆子，從圖2A 可以看出，PCR 產(chǎn)物pdc1-loxP-kanMX片段與目的片段大小相同，為1693 bp，與預(yù)期結(jié)果相符；從圖2B 可以看出，PCR 產(chǎn)物pdc5-loxP-kanMX（1672 bp）片段與預(yù)期片段大小相符。

片段pdc1-loxp-kanMX、pdc5-loxP-kanMX純化后分別連接到克隆載體pMD18-T、pEASY-T3 上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，從每種轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取17 個(gè)白色菌落進(jìn)行菌液PCR 鑒定。圖3A 中泳道1、3、5、7、15、17 號(hào)陽(yáng)性克隆子擴(kuò)增得到的片段均與pdc1-loxP-kanMX大小相符（1693 bp），圖3B 中泳道1、2、3、4、5、12 號(hào)陽(yáng)性克隆子擴(kuò)增得到的片段均與pdc5-loxP-kanMX片段大小相符（1672 bp），說(shuō)明目的基因pdc1-loxP-kanMX與質(zhì)粒pMD18-T連接成功，pdc5-loxP-kanMX與質(zhì)粒pEASY-T3 連接成功。從轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒pMD18-T、pEASY-T3 中選取陽(yáng)性克隆子提取質(zhì)粒，分別經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ單酶切驗(yàn)證，將目的片段測(cè)序后與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)pdc1-loxP-kanMX、pdc5-loxP-kanMX核苷酸序列與NCBI 中公開(kāi)的基因序列相似度達(dá)100%，未發(fā)生堿基突變。

2.2 缺失菌株的篩選與鑒定

pdc1、pdc5基因敲除轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證分別見(jiàn)圖4、5，在B1-C1（732 bp）、A1-B1（1202 bp）、A1-D1（1732 bp）、C1-D1（1066 bp）與A5-D5（1185 bp）、B1-C1（732 bp）處均有清晰條帶出現(xiàn)，與預(yù)期片段大小相符。

圖4 用引物B1-C1（A）、A1-B1（B）、A1-D1（C）、C1-D1（D）的PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證

圖5 用引物A5-D5（A）、B1-C1（B）的PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證

2.3 G418抗性的消除

用引物pdc1-A1 和pdc1-D1、pdc1-B1 和pdc1-C1 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，驗(yàn)證抗性片段kanMX的結(jié)果如圖6，在A1-D1（262 bp）處有清晰條帶出現(xiàn)，而B(niǎo)1-C1（732 bp）處未擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明kanMX片段已消除，并敲除了pdc1、pdc5。

圖6 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證kanMX、pdc1、pdc5 基因

圖7 工程菌株的發(fā)酵變化曲線

2.4 重組菌株搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)

圖7A 所示，菌株H5/H5-01/H5-02 發(fā)酵12 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，36 h 達(dá)到穩(wěn)定期，但重組菌株H5-01 和H5-02 的長(zhǎng)勢(shì)略低于H5，D600nm值較原始菌株分別降低了16.89%、13.80%。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是敲除pdc1和pdc5后不同程度影響了菌株生長(zhǎng)及體內(nèi)的酸堿平衡，進(jìn)而使菌株生長(zhǎng)呈現(xiàn)緩慢趨勢(shì)。在0～12 h 時(shí)pH 值總體呈上升趨勢(shì)，但24 h 后重組菌株的pH 值高于原始菌株，可能是重組菌株的丙酮酸脫羧酶基因被破壞，導(dǎo)致其乙酸產(chǎn)量降低，使其pH 值略高。圖7B 所示，經(jīng)HPLC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組菌株乙醇產(chǎn)量明顯低于原始菌株，H5-01、H5-02 的最高乙醇產(chǎn)量分別為35.946±0.918、34.680±0.887 g/L，較原始菌株H5 乙醇產(chǎn)量（42.056±0.880 g/L）分別下降了14.53%與17.54%。此外，重組菌株的2，3-BD 積累量明顯高于原始菌株，最高產(chǎn)量為0.264±0.015 g/L。由此可見(jiàn)，含有pdc1、pdc5同源序列線性片段的敲除質(zhì)粒pTWCL-PDC1 與pTWCL-PDC5 構(gòu) 建成功，導(dǎo)致重組菌株的丙酮酸脫羧酶活性降低，乙醇產(chǎn)量明顯下降，并且流向乙醇的部分碳源流向了2，3-BD 的生成方向，使其2，3-BD 產(chǎn)量得到提高。

3 討論

作為一種單細(xì)胞真核生物，釀酒酵母易于培養(yǎng)，其遺傳操作技術(shù)成熟，相關(guān)理論研究較為清楚，可以利用基因工程手段對(duì)釀酒酵母進(jìn)行更加準(zhǔn)確的改造[15-16]。其中，利用Cre-loxP 重組酶技術(shù)可以準(zhǔn)確、高效地敲除靶基因，而且標(biāo)記基因也可以被選擇性切除。林曉華等[17]擴(kuò)增帶有kanr篩選標(biāo)記的SNF4基因敲除組件，轉(zhuǎn)化釀酒酵母，利用Cre-LoxP 重組酶技術(shù)切除kanr篩選標(biāo)記并獲得SNF4等位基因完全缺失菌株。Semkiv 等[18]從大腸桿菌中克隆獲得kanMX4，將該基因與報(bào)告基因PHO8（編碼堿性磷酸酶）相連，構(gòu)建多拷貝數(shù)的整合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化釀酒酵母，使其具有更高的抗生素抗性。本研究通過(guò)PCR 克隆得到pdc1-loxP-kanMX基因片段，采用同源重組原理構(gòu)建表達(dá)載體，該載體含有基因敲除組件與篩選標(biāo)記基因（loxP-kanMX-loxP），在一定程度上可作為敲除釀酒酵母相關(guān)基因的技術(shù)參考。

丙酮酸是糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，連接許多代謝途徑，PDC 是釀酒酵母代謝途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，其活性主要由pdc1、pdc5和pdc6這3個(gè)基因控制，可以使丙酮酸生成乙醛，然后通過(guò)醛醇縮合反應(yīng)合成少量的乙偶姻，并進(jìn)一步生成2，3-BD[19-20]。我們構(gòu)建了含有pdc1、pdc5同源序列線性片段的敲除質(zhì)粒pTWCL-PDC1 與pTWCLPDC5，并將其分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母H5，通過(guò)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組菌株的乙醇產(chǎn)量較原始菌株明顯下降，而2，3-BD 產(chǎn)量明顯上升，表明構(gòu)建后的質(zhì)粒對(duì)釀酒酵母的PDC 活性產(chǎn)生了影響。丙酮酸在PDC 作用下生成乙醛，乙醛又能生成乙醇[21]，質(zhì)粒pTWCL-PDC1 與pTWCL-PDC5 使釀酒酵母H5 的pdc1、pdc5基因被分別敲除，菌株的丙酮酸脫羧酶活性減弱，中間產(chǎn)物丙酮酸大量積累，減少了乙醇的產(chǎn)生，使碳源更多流向2，3-BD 產(chǎn)生途徑。吳滿珍等[22]構(gòu)建含有pdc1和adh1同源序列的質(zhì)粒，將其導(dǎo)入釀酒酵母CEN.PK2-1C，重組菌株的最高乙醇產(chǎn)量較野生菌株下降了63.8%，而丙酮酸達(dá)到2.0 g/L。Lian 等[23]構(gòu)建了質(zhì)粒pRS426，通過(guò)同源重組方法使野生型釀酒酵母體內(nèi)同時(shí)缺失pdc1、pdc5、pdc6基因，并過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子MTH1，利用葡萄糖和半乳糖作為底物，通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵，其2，3-BD 產(chǎn)量提高到100 g/L。

綜上，我們依據(jù)NCBI 獲得pdc1、pdc5基因左右兩端各40 bp 同源序列，以pUG6 質(zhì)粒DNA 為模板設(shè)計(jì)引物，PCR 分別擴(kuò)增兩端各含40 bppdc1、pdc5同源序列的基因敲除片段pdc1-loxP-kanMX、pdc5-loxP-kanMX，分別插入質(zhì)粒pMD18-T、pEASY-T3，得到重組表達(dá)載體pTWCL-PDC1與pTWCL-PDC5，并將其分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母H5，搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組菌株乙醇產(chǎn)量明顯下降，PDC 活性降低。研究結(jié)果表明，含有釀酒酵母pdc1、pdc5同源序列的loxP-kanMX-loxP質(zhì)粒構(gòu)建成功，釀酒酵母中的pdc1、pdc5基因被成功敲除。