祁昕，齊書(shū)山，吳鵬濤

北京市房山區(qū)良鄉(xiāng)醫(yī)院 胸心血管外科，北京102400

肺癌位列全球癌癥相關(guān)死亡原因之首[1]，其中約85%的肺癌被歸類為非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC），其被細(xì)分為鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌和大細(xì)胞癌。肺腺癌是最常見(jiàn)的肺癌亞類，占NSCLC 病例的65%，占所有肺癌的40%以上[2]。因此，了解肺腺癌的致癌信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，確定治療該疾病的新治療靶點(diǎn)很有必要。

研究證實(shí)，肺腺癌的發(fā)生與體內(nèi)一些基因（包括癌基因、抑癌基因等）的突變有關(guān)[3-8]。人類復(fù)制因子C 第四大亞基（human replication factor C subunit 4，RFC4）在DNA 合成和DNA 損傷后的DNA 修復(fù)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[9-10]。據(jù)報(bào)道，該基因在多種惡性腫瘤，如前列腺癌、宮頸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和肝癌中表達(dá)失調(diào)[11-16]。然而，RFC4 在肺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用仍不清楚。在本研究中，我們探討了RFC4 在肺腺癌中的表達(dá)水平，并確定了RFC4 在肺腺癌中的潛在生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1437，人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；RFC4 抗體、β-actin 抗體和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗購(gòu)自Abcam 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green 染料購(gòu)自TaKa-Ra 公司；10%胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone 公 司；LipofectAMINE RNAiMAX Reagent試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen 公司；Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司；Transwell 小室購(gòu)自Corning 公司。

1.2 數(shù)據(jù)挖掘分析

通過(guò)starBase Pan-Cancer 分析平臺(tái)（http://starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php）分析從癌癥基因組圖譜（TCGA）獲取的RFC4 在肺腺癌組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)；通過(guò)Kaplan-Meier plotter 分析平臺(tái)（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background）分析RFC4 基因與肺腺癌生存預(yù)后的關(guān)系。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，在37℃含5% CO2的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用LipofectAMINE RNAiMAX Reagent 試劑盒轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，敲低RFC4 的表達(dá)。siRNA 序列為RFC4 siRNA sense（5'-GACCAAGGAUCGAGGAGUAdTd T-3'）和RFC4 siRNA antisense（3'-dTdTCUGGUU CCUAGCUCCUCAU-5'）。

1.4 RNA提取和qRT-PCR

用TRIzol 試劑盒提取總RNA，PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA，用ABI PRISM 7500 Fast Real-time PCR System 檢測(cè)儀和SYBR Green qPCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。以β-actin 為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。RFC4 正向引物為5'-TT GTATCGCGGAAACCTGAGGAAC-3'，反向引物為5'-ACTGGCAGCTACTCCTCGATCCTT-3'；β-actin正向引物為5'-TGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3'，反向引物為5'-TCGGCCACATTGTGAACTTT-3'。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡

提取細(xì)胞總蛋白，10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白，用電轉(zhuǎn)儀將膠上蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用含5%脫脂奶粉的PBST 溶液封閉膜后，將膜與抗體孵育過(guò)夜，PBST 清洗后再與二抗孵育，清洗后加入化學(xué)顯色液，放至凝膠成像儀中觀察。

1.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成懸液，以1×105/孔接種于96 孔板，分別在1、2、3 和4 d 進(jìn)行CCK-8 檢測(cè)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值，D450nm值與活細(xì)胞數(shù)量成正比。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、D450nm值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)圖。

1.7 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL。在下室加入600 μL 含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入150 μL 細(xì)胞懸液，每種細(xì)胞種3 個(gè)小室，培養(yǎng)24 h 后取出小室，擦去小室內(nèi)表面未穿膜的細(xì)胞，甲醇固定15 min，DPAI 染核10 min，PBS 清洗后，在熒光顯微鏡下觀察視野并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.8 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲

將凍存的Matrigel 基質(zhì)膠于4℃放置至液態(tài)，與無(wú)血清培養(yǎng)基以5∶1 混勻，每個(gè)小室加入100 μL 混合液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育5 h。其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用GraphPad Prism 6 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以為x±s表示，組間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)和方差分析，兩兩多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RFC4在肺腺腺癌組織中的表達(dá)

starBase 分析526 例肺腺癌組織和59 例正常對(duì)照組織結(jié)果顯示（圖1），RFC4 在肺腺癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組織（P＜0.05），說(shuō)明RFC4 在肺腺癌組織中高表達(dá)。

圖1 starBase 分析TCGA 中RFC4 在肺腺癌組織中的表達(dá)

2.2 RFC4表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

利用Kaplan-Meier plotter 分析RFC4 表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)圖2，高水平的RFC4 表達(dá)與不良總生存期（OS）和無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）顯著相關(guān)（P分別為0.0018、0.021），RFC4表達(dá)越高，患者的OS 和RFS 就越低，預(yù)后越差。

圖2 RFC4 表達(dá)對(duì)肺腺癌預(yù)后的影響

2.3 RFC4在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

從圖3 可以看出，RFC4 在2 種肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1437 中的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B（P＜0.05），這與RFC4 在肺腺癌組織中的表達(dá)一致。

2.4 RFC4siRNA沉默效率檢測(cè)

為了進(jìn)一步研究RFC4 在肺腺癌細(xì)胞中的功能，將RFC4 siRNA 分別轉(zhuǎn)染A549 和H1437 細(xì)胞，并在mRNA 和蛋白水平檢測(cè)RFC4 siRNA 的沉默效率，結(jié)果見(jiàn)圖4。轉(zhuǎn)染siRNA 后，A549 和H1437細(xì)胞中的RFC4 mRNA 表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；同樣地，A549 和H1437 細(xì)胞中的RFC4 蛋白表達(dá)也明顯低于對(duì)照（P＜0.05）。

2.5 RFC4siRNA對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染RFC4 siRNA 后，RFC4 的表達(dá)降低（圖4），si-RFC4 肺腺癌細(xì)胞的增殖活力也明顯降低（圖5）。同時(shí)，隨著RFC4 的表達(dá)降低，si-RFC4 肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力也顯著低于對(duì)照（圖6）。此結(jié)果說(shuō)明，RFC4 的表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有促進(jìn)作用。

圖3 RFC4 在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

圖4 RFC4 siRNA 轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞后RFC4 的表達(dá)

圖5 RFC4 siRNA 對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖的影響（*P＜0.05）

圖6 RFC4 siRNA 對(duì)肺腺癌細(xì)胞遷移/侵襲的影響（*P＜0.05）

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤[1]。肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)的亞型，每年致50 多萬(wàn)人死亡[17]。雖然目前用于治療肺癌的靶向藥物已經(jīng)獲得了一些進(jìn)展，但耐藥、復(fù)發(fā)等問(wèn)題也隨著靶向藥物的使用而出現(xiàn)，所以探究肺癌的治療靶點(diǎn)仍十分必要。

RFC4 在真核生物DNA 復(fù)制和DNA 損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[9-10]。癌細(xì)胞無(wú)限增殖和易分散轉(zhuǎn)移的生物特性，可能與癌細(xì)胞中RFC4 的表達(dá)失調(diào)有關(guān)。先前的研究表明RFC4 在不同癌癥中高表達(dá)也證明了這一點(diǎn)，如在結(jié)直腸癌、肝癌中RFC4 均過(guò)度表達(dá)[15-16]。在本研究中，RFC4 在肺腺癌組織和細(xì)胞中均高表達(dá)，并且與肺腺癌預(yù)后有較強(qiáng)的相關(guān)性，RFC4 表達(dá)越高，肺腺癌患者的總生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存期越低，預(yù)后較差。這些結(jié)果表明RFC4 可能在肺腺癌中發(fā)揮致癌作用。

為了進(jìn)一步研究RFC4 與肺腺癌細(xì)胞增殖之間的關(guān)系，我們通過(guò)RFC4 siRNA 轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞，敲低了RFC4 在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。采用CCK-8 法和Transwell 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RFC4 的表達(dá)降低使肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著下降，說(shuō)明RFC4 在肺腺癌細(xì)胞增殖進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。

綜上所述，RFC4 在肺腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，且與肺腺癌預(yù)后關(guān)系密切。RFC4 的表達(dá)促進(jìn)了肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究為開(kāi)發(fā)肺腺癌新的預(yù)后標(biāo)志物提供了研究思路，RFC4 可以作為肺腺癌新的治療策略的潛在靶標(biāo)，但涉及的詳細(xì)分子機(jī)制仍須進(jìn)一步探究。