尹培永，崔小紅，熊婷，何喜民

海南省三亞市 中醫(yī)院，海南 三亞572000

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是冠心病患者再血管化的主要手段。然而PCI 治療在使患者獲益的同時(shí)，也會(huì)帶來支架內(nèi)再狹窄（in-stent restenosis，ISR）等新的風(fēng)險(xiǎn)。雖然藥物洗脫支架的使用已經(jīng)大大降低了ISR 的發(fā)生，但目前ISR 仍有5%～10%的發(fā)生率[1-3]。因此，如何有效防治ISR 一直是冠脈介入治療領(lǐng)域的一大難題。microRNAs（miRNAs）是一類長約22 個(gè)堿基的非編碼小分子單鏈RNA，通常在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)[4]。miRNAs 在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用。研究表明，miRNAs 可作為預(yù)測ISR 的標(biāo)志物，還可以作為ISR 治療靶點(diǎn)，但miRNAs 在ISR中的作用及機(jī)制遠(yuǎn)未完全闡明[5]。為了進(jìn)一步系統(tǒng)揭示miRNAs 在ISR 中的調(diào)控作用及機(jī)制，我們利用GEO 數(shù)據(jù)庫中的芯片數(shù)據(jù)，分析了ISR 中的差異表達(dá)miRNAs 及其作用靶基因，希望能夠?yàn)镮SR 的防治提供新的線索和思路。

1 資料與方法

1.1 miRNAs芯片數(shù)據(jù)來源和再分析

由NCBI 公共數(shù)據(jù)平臺(tái)GEO（Gene Expression Omnibus）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載miRNAs 芯片數(shù)據(jù)GSE60959[6]。芯片平臺(tái)是Illumina 公司的GPL8179，版本為Illumina Human v2 microRNA expression beadchip。GSE60959 數(shù)據(jù)集包含6 例ISR 患者（試驗(yàn)組）和4 例非ISR 健康對(duì)照者（對(duì)照組）。接受藥物涂層支架植入的急性心肌梗死或病變血管完全閉塞的冠心病患者，術(shù)后6～12 個(gè)月隨訪，行經(jīng)狀動(dòng)脈造影檢查。造影顯示植入支架血管直徑狹窄程度≥50%者定義為ISR，入選為試驗(yàn)組。對(duì)照組為健康志愿者。2 組在性別、年齡、吸煙史、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、高血壓/糖尿病病史方面無明顯差異。該研究是對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)再分析，未進(jìn)行人體或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此不涉及倫理及知情同意書事項(xiàng)。

將原始芯片數(shù)據(jù)（CEL files）導(dǎo)入GeneSpringGX 軟件進(jìn)行再處理，首先可以得到主成分分析結(jié)果，用來展示2 組間miRNAs 整體表達(dá)情況是否存在差異；進(jìn)一步采用非配對(duì)t檢驗(yàn)和Benjamini-Hochberg 錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率校正法篩選2 組間差異表達(dá)miRNAs，同時(shí)滿足差異倍數(shù)＞5 和P＜0.01 的miRNAs 為最終差異表達(dá)miRNAs，結(jié)果以火山圖形式展示。

1.2 miRNAs靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測

采用miRNAs 靶基因預(yù)測算法TargetScan（www.targetscan.org/）和miRanda（mirracle.igib.res.in/miracle/），預(yù)測ISR 組和對(duì)照組之間差異表達(dá)循環(huán)miRNAs 的靶基因，同時(shí)被2 個(gè)預(yù)測軟件預(yù)測得到的靶基因納入下一步信號(hào)通路富集分析。

1.3 基于miRNAs-靶基因的KEGG信號(hào)通路富集分析

將預(yù)測得到的miRNAs 靶基因輸入DAVID 平臺(tái)（https://david-d.ncifcrf.gov/），經(jīng)由KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，得到靶基因主要參與的信號(hào)通路。miRNAs 與其靶向信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系由Cytoscape 3.0.0 beta 1（www.cytoscape.org）實(shí)現(xiàn)可視化。

1.4 差異表達(dá)miRNAs靶基因的驗(yàn)證

由GEO 公共數(shù)據(jù)平臺(tái)下載另一個(gè)mRNAs 芯片數(shù)據(jù)GSE46560，芯片平臺(tái)是Affymetrix 公司的GPL15207，版本為［PrimeView］Affymetrix Human Gene Expression Array。該數(shù)據(jù)包括5 例ISR 患者和6 例非ISR 患者。經(jīng)GeneSpringGX 軟件分析，得到2 組間差異表達(dá)mRNAs，差異靶基因的設(shè)置參數(shù)為差異倍數(shù)＞1.5 和P＜0.01。將這些mRNAs與miRNAs 預(yù)測靶基因取交集，得到miRNAs 調(diào)控ISR 所作用的潛在基因。

2 結(jié)果

2.1 ISR組與對(duì)照組差異表達(dá)miRNAs

經(jīng)GeneSpringGX 軟件對(duì)芯片數(shù)據(jù)GSE60959再分析，發(fā)現(xiàn)2 組間miRNAs 表達(dá)有明顯不同（圖1A）。與對(duì)照組相比，ISR 組存在131 個(gè)差異表達(dá)循 環(huán)miRNAs，其中上調(diào)41 個(gè)，下 調(diào)90 個(gè)（圖1B）。前5 個(gè)上調(diào)miRNAs 見表1。

表1 前5個(gè)上調(diào)miRNAs

2.2 差異表達(dá)miRNAs靶向信號(hào)通路富集分析

為了解上述差異表達(dá)miRNAs 在ISR 中的潛在作用，我們對(duì)前5 個(gè)miRNAs 的靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，通過TargetScan 和miRanda 預(yù)測算法將靶基因取交集后，共得到6587 個(gè)基因。隨后將這些基因輸入DAVID 平臺(tái)，經(jīng)由KEGG 數(shù)據(jù)庫得到這些miRNAs 靶向的信號(hào)通路。Cytoscape 軟件構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，hsa-miR-512 靶向信號(hào)通路最多（圖2）。其中同時(shí)被3 個(gè)及以上miRNAs靶向的信號(hào)通路及參與基因見表2，這些信號(hào)通路主要包括MAPK signaling pathway、ErbB signaling pathway、Wnt signaling pathway、Focal adhesion、Neurotrophin signaling pathway 和Regulation of actin cytoskeleton。

圖1 ISR 組與對(duì)照組循環(huán)miRNAs 差異表達(dá)譜

2.3 ISR相關(guān)mRNAs芯片數(shù)據(jù)中驗(yàn)證miRNAs靶基因

用GeneSpringGX 軟件對(duì)mRNAs 芯片數(shù)據(jù)GSE46560 進(jìn)行再分析，結(jié)果表明ISR 組與非ISR組間的mRNAs 表達(dá)譜存在差異。與非ISR 組相比，ISR 組有171 個(gè)差異表達(dá)mRNAs，其中下調(diào)106 個(gè)。將106 個(gè)下調(diào)mRNAs 與5 個(gè)上調(diào)最明顯的miRNAs 的6587 個(gè)靶基因取交集，最后得到43個(gè)受miRNAs 抑制的潛在靶基因（圖3）。用Cytoscape 構(gòu)建5 個(gè)miRNAs 與43 個(gè)下調(diào)靶基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，顯示miR-512 抑制的靶基因最多（圖4）。

表2 同時(shí)被3個(gè)及以上miRNAs靶向的信號(hào)通路及參與基因

圖2 ISR 患者中前5 個(gè)上調(diào)最明顯循環(huán)miRNAs 靶向的信號(hào)通路

圖3 驗(yàn)證ISR 患者中前5 個(gè)上調(diào)循環(huán)miRNAs 靶基因的分析流程

3 討論

本研究中，我們在GEO 數(shù)據(jù)庫中篩選到ISR患者的miRNAs 和mRNAs 芯片數(shù)據(jù)，通過對(duì)2 部分?jǐn)?shù)據(jù)的再分析，發(fā)現(xiàn)了在ISR 中上調(diào)最明顯的5個(gè)miRNAs 及其作用的信號(hào)通路和43 個(gè)潛在靶基因，并構(gòu)建了miRNAs 在ISR 中的信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其與靶基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，闡釋了miRNAs在ISR 調(diào)控作用及潛在機(jī)制。

ISR 發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，其中內(nèi)皮損傷、炎癥細(xì)胞招募和激活，血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖和遷移（即由靜態(tài)的“收縮”表型轉(zhuǎn)向增殖的“合成”表型），導(dǎo)致新生內(nèi)膜過度增生，是ISR 的共同特征和基本機(jī)制[7]。研究表明，miRNAs 在血管損傷所致的上述病理改變中具有重要調(diào)控作用。miR-92a 在內(nèi)皮細(xì)胞中含量豐富，血管損傷后其表達(dá)顯著增高，抑制miR-92a 水平后，可以加速再內(nèi)皮化、抑制炎癥反應(yīng)，且不影響VSMCs 的功能，最終使內(nèi)膜新生及ISR 被抑制[8-9]。miR-21 通過促進(jìn)VSMCs 增殖，促進(jìn)內(nèi)膜新生，抑制miR-21 可以降低豬和小鼠的ISR[10]。特別是有研究發(fā)現(xiàn)，miR-221/222 在血管內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs 中具有相反的生物學(xué)作用，拮抗miR-221/222 后，既可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加速再內(nèi)皮化，又可抑制VSMCs 增殖和遷移，減輕內(nèi)膜增生[11]。由此可見，miRNAs 是防治 ISR的重要靶點(diǎn)。

圖4 ISR 患者中前5 個(gè)上調(diào)循環(huán)miRNAs 與ISR 患者中43 個(gè)下調(diào)靶循環(huán)mRNAs 的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

本研究選取ISR 患者循環(huán)中上調(diào)最明顯的前5 個(gè)差異表達(dá)miRNAs，進(jìn)行靶基因預(yù)測及KEGG信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些miRNAs 主要靶向的信號(hào)通路包括MAPK signaling pathway、ErbB signaling pathway、Wnt signaling pathway、Focal adhesion、Neurotrophin signaling pathway、Regulation of actin cytoskeleton 和mTOR signaling pathway，這些信號(hào)通路涉及細(xì)胞增殖、遷移、黏附等，均與ISR 病理過程密切相關(guān)。為了進(jìn)一步確定5個(gè)差異表達(dá)miRNAs 的作用靶點(diǎn)，我們分析了另一組ISR 患者的差異循環(huán)mRNAs，然后將預(yù)測得到的miRNAs 靶基因與該芯片中的下調(diào)基因取交集，最終發(fā)現(xiàn)43 個(gè)共有基因。其中，hsa-miR-512靶向的基因及信號(hào)通路均最多，提示miR-512 在ISR 中具有重要的調(diào)控作用。

綜上，本研究系統(tǒng)揭示了miRNAs 在ISR 中的調(diào)控作用，為ISR 的發(fā)生機(jī)制及預(yù)防研究提供了理論依據(jù)，這些ISR 循環(huán)中差異表達(dá)miRNAs 的確切作用可通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。