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        圣愈湯聯(lián)合放射治療對人宮頸癌荷瘤小鼠脾臟 DCs 細胞功能的影響*

        2019-09-17 01:25:24孫立哲李磊強耿翠翠劉寶剛
        陜西中醫(yī) 2019年9期
        關(guān)鍵詞:脾臟活化細胞因子

        孫立哲,李磊強,耿翠翠,張 楊,劉寶剛

        陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(咸陽 712000)

        圣愈湯出自清代吳謙編寫的《醫(yī)宗金鑒》,由熟地、白芍、川芍、當(dāng)歸、人參、黃芪組成,是益氣補血的常用方。在臨床中也有不少醫(yī)生用本方來輔助治療惡性腫瘤,改善患者放療后的機能狀況,提高免疫力[1]。在腫瘤免疫治療中,樹突狀細胞(DCs)在其中起著關(guān)鍵的作用 ,DCs能通過識別腫瘤細胞特異性抗原,與T淋巴細胞結(jié)合并激活 T 細胞增殖,誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)生成,介導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答 ,起到監(jiān)測、殺滅腫瘤的功能[2-3]。本研究觀察了圣愈湯聯(lián)合放療對荷瘤小鼠脾臟DCs活性、細胞因子分泌的影響。

        資料和方法

        1 材 料 健康6~7周齡雌性昆明種小鼠,體重 18-22 g,購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。 宮頸癌Hela細胞株購自中科院細胞庫。圣愈湯生藥飲片 (熟地黃、 白芍、當(dāng)歸、川芎、人參、黃芪)購于仁和大藥房,按人參 (用生曬參)9 g, 黃芪20 g, 熟地、 白芍各 15 g, 當(dāng)歸、 川芎各 10 g 的比例,取中藥浸泡 1 h, 文火煎煮約 1 h, 過濾并濃縮至生藥 1 g/ml,無菌分裝, 置于 4 ℃冰箱保存。CD11c、CD86、 MHC-Ⅱ等流式檢測抗體購自eBioscience公司,ELISA 檢測試劑盒購自 R&D 公司,LDH 試劑盒購自 Thermo 公司,磁珠分選系統(tǒng)購自 BD 公司。放療設(shè)備為大恒公司6MV-X線治療機。

        2 研究方法

        2.1 Hela細胞培養(yǎng):人宮頸癌Hela細胞株,購自中科院細胞庫。使用含10%小牛血清的髙糖DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。使用接種后處于對數(shù)生長期的細胞作為實驗細胞。

        2.2 小鼠宮頸癌模型的建立:取健康昆明種小鼠,復(fù)蘇傳代Hela細胞株,待Hela細胞生長至5×109/ml時胰酶消化,培養(yǎng)基終止消化,離心取沉淀,計數(shù)后調(diào)整細胞密度。采用細胞懸液皮下種植法制備荷瘤鼠模型,小鼠雙側(cè)大腿內(nèi)側(cè)皮下接種細胞懸液0.2 ml(約1×108個/ml細胞),隔天觀察小鼠皮下宮頸癌的成瘤及生長情況,直至腫瘤大小約為5 mm×5 mm×5 mm,隨機抽取3只小鼠,取腫瘤組織行HE染色進行形態(tài)學(xué)觀察,確定荷宮頸癌小鼠模型的成功建立。

        2.3 實驗分組及處理:將成功建立的荷瘤小鼠模型隨機分為對照組、圣愈湯組、放療組和圣愈湯聯(lián)合放療組,每組10只。對照組:不做治療。圣愈湯組:以圣愈湯0.4 ml灌胃,連續(xù)給藥2周。放療組:給予6MV-X線局部照射,劑量20Gy/2d,小鼠移植瘤皮膚表面予以凡士林均勻涂抹做劑量補償,其余部位予以鉛擋保護,源皮距100 cm。圣愈湯聯(lián)合放療組:圣愈湯給藥時間同圣愈湯組,局部放療時間同放射組。

        2.4 流式細胞術(shù)檢測脾臟DCs的活化情況:在給藥至14 d時,取各組小鼠新鮮脾臟組織修剪成5 mm×5 mm×5 mm大小的組織塊,PBS沖洗后,置于培養(yǎng)皿內(nèi),在尼龍網(wǎng)上使用5 ml注射器柱塞行機械研磨,制成勻漿,300 μlPBS混勻;加入3倍體積的紅細胞裂解液4℃,靜置5 min;低溫離心5 min,倒掉上清液,400μlPBS重懸,調(diào)整細胞密度為1×106/ml;滴加抗體:a管為空白管,不加入任何抗體;b管為同型對照管,加入c管所加抗體等量的同種屬同型對照抗體;c管滴加不同巧光素標記的CD11c、CD86、MHC-Ⅱ抗體。震蕩器混勻,室溫避光孵育30 min,PBS洗滌,離心,300 g×5 min,棄上清,低溫PBS洗涂兩次,然后200μlPBS重懸,加入流式管中,4℃避光保存;流式細胞儀檢測分析。

        2.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測脾臟細胞IFN-γ的分泌水平:治療 14 d后,取出各組小鼠脾臟,剪碎成1 cm3大小組織塊,研磨組織至勻漿狀,適量生理鹽水沖洗研磨器并收集懸液, 經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾,850轉(zhuǎn)/min離心2 min,棄上清,生理鹽水洗滌3次,離心去上清后,用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液重懸,制成密度為 1×107/ml細胞懸液;再次離心取沉淀,按10倍細胞壓積的比例加入紅細胞裂解液,混合,靜置5 min后用 PBS沖洗后,以含2%FBS 的保護液重懸沉淀,加入LC分離液,離心后取中間層細胞,PBS 洗滌后重懸,使用MACS磁珠分選系統(tǒng)分離出 DCs,37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后收集上清。用ELISA法檢測上清中的 IFN-γ含量,按試劑盒說明書進行操作,結(jié)果在酶標儀450 nm處檢測OD值,繪制標準曲線,計算質(zhì)量濃度,單位是pg/ml。

        2.6 LDH實驗檢測脾臟細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)殺傷活性:無菌取小鼠脾臟,制備脾細胞懸液,并分離CD8+CTLs。以CD8+CTLs為效應(yīng)細胞,宮頸癌Hela細胞為靶細胞,將效應(yīng)細胞及靶細胞按20∶1比例混合,接種于培養(yǎng)瓶,37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h;PBS重懸細胞,加入細胞裂解液 4℃低溫裂解 5 min,12 000轉(zhuǎn)/min離心3 min, 取上清為細胞裂解產(chǎn)物。使用LDH 試劑盒檢測CD8+CTLs 殺傷活性 ;細胞殺傷活性計算;殺傷率(%)=(實驗組A值-效應(yīng)細胞自然釋放組A值-靶細胞自然釋放組A值)/(最大釋放組A值-靶細胞自然釋放組A值)×100%。

        結(jié) 果

        1 各組小鼠脾臟DCs活化情況 小鼠經(jīng)圣愈湯灌胃第7天時,圣愈湯組、放療組及圣愈湯聯(lián)合放療組脾臟活化DCs數(shù)量均較對照組升高(P<0.05),且圣愈湯聯(lián)合放療組活化DCs更高(P<0.05),見表1。

        表1 脾臟DCs活化情況流式細胞測定結(jié)果

        注:與對照組比較,*P<0.05;組間比較, #P<0.05

        2 各組小鼠細胞因子分泌水平 圣愈湯組、放療組及圣愈湯聯(lián)合放療組INF-γ分泌量均較對照組升高(P<0.05),且圣愈湯聯(lián)合放療組INF-γ分泌量與其余各組比較更高(P<0.05),見表2。

        3 圣愈湯聯(lián)合放療可明顯提高脾臟CD8+CTLs殺傷活性 圣愈湯組、放療組及圣愈湯聯(lián)合放療組脾臟CD8+CTLs殺傷均較對照組升高(P<0.05),且圣愈湯聯(lián)合放療組脾臟CD8+CTLs殺傷與其余各組比較更高(P<0.05),見表3。

        表2 各組小鼠細胞因子分泌水平

        注:與對照組比較,*P<0.05;組間比較, #P<0.05

        表3 各組小鼠CD8+CTLs殺傷活性檢測結(jié)果(%)

        注:與對照組比較,*P<0.05;組間比較, #P<0.05

        討 論

        圣愈湯以補益元氣的人參和滋陰養(yǎng)血的熟地為主藥,輔以黃芪健脾益氣,白芍斂陰養(yǎng)血,當(dāng)歸、川芎補血活血,共奏益氣補血之效[4-5]。有研究表明,圣愈湯能調(diào)整免疫抑制小鼠的T細胞亞群分布及細胞因子含量,對小鼠免疫功能有一定的促進和調(diào)節(jié)作用[6-8];本實驗在此基礎(chǔ)上,觀察圣愈湯聯(lián)合放療對荷宮頸癌小鼠脾臟DCs分泌細胞因子及CTLs對腫瘤細胞殺傷活性的影響,以進一步明確圣愈湯的免疫調(diào)節(jié)作用及其機理。

        樹突狀細胞(DCs)機體重要的抗原提呈細胞,通過表達豐富的MHC分子、共刺激分子及粘附分子,刺激T細胞增殖,誘導(dǎo)抗原特異性的CTL細胞生成,從而在腫瘤免疫中起主導(dǎo)作用[9-11]。 本實驗通過流式細胞術(shù)檢測經(jīng)圣愈湯及放療干預(yù)后各組小鼠脾臟的DCs活化情況,結(jié)果表明:圣愈湯組、放療組及圣愈湯聯(lián)合放療組脾臟活化DCs數(shù)量均較對照組升高,且圣愈湯聯(lián)合放療組活化DCs更高。說明圣愈湯促進了體內(nèi)DC的分化、成熟,而放療組DCs也出現(xiàn)活化增多,則可能與放療后腫瘤細胞壞死,抗原物質(zhì)釋放后激活機體抗腫瘤免疫有關(guān);而圣愈湯聯(lián)合放療后可放大這種腫瘤免疫反應(yīng)。

        DCs細胞活化后,可將抗原提呈給CD4+T細胞,調(diào)節(jié)CD4+T細胞分化為Th1/Th2細胞,其中Th1可通過分泌多種細胞因子(如INF-γ)參與細胞免疫,具有顯著的抗腫瘤作用;同時DCs攝取抗原后,可激活CD8+T細胞,增強CTLs殺傷活性,產(chǎn)生對宮頸癌特異性的細胞毒性殺傷作用[12];本研究結(jié)果表明:圣愈湯及圣愈湯聯(lián)合放療均能增加INF-γ的分泌,并由此促進CTLs細胞的成熟活化,增強CTLs殺傷活性;且提示聯(lián)合治療更有效激活抗原提呈細胞,增強機體的抗腫瘤免疫。

        綜上所述,圣愈湯可促進荷瘤小鼠脾DC的分化、成熟,增加INF-γ分泌,誘導(dǎo)T淋巴細胞向CTLs的分化,增強CTLs殺傷活性,進而提高小鼠抗腫瘤免疫;并且圣愈湯聯(lián)合放療后,可放大其免疫促進作用;而這種免疫增強作用是否持久,能否達到穩(wěn)定的治療效果,則還需進一步的研究。

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