孫立哲，李磊強，耿翠翠，張 楊，劉寶剛

陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(咸陽 712000)

圣愈湯出自清代吳謙編寫的《醫(yī)宗金鑒》,由熟地、白芍、川芍、當(dāng)歸、人參、黃芪組成,是益氣補血的常用方。在臨床中也有不少醫(yī)生用本方來輔助治療惡性腫瘤,改善患者放療后的機能狀況，提高免疫力[1]。在腫瘤免疫治療中，樹突狀細胞(DCs)在其中起著關(guān)鍵的作用 ，DCs能通過識別腫瘤細胞特異性抗原，與T淋巴細胞結(jié)合并激活 T 細胞增殖，誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)生成，介導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答 ，起到監(jiān)測、殺滅腫瘤的功能[2-3]。本研究觀察了圣愈湯聯(lián)合放療對荷瘤小鼠脾臟DCs活性、細胞因子分泌的影響。

資料和方法

1 材 料 健康6～7周齡雌性昆明種小鼠，體重 18-22 g，購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。 宮頸癌Hela細胞株購自中科院細胞庫。圣愈湯生藥飲片 (熟地黃、 白芍、當(dāng)歸、川芎、人參、黃芪)購于仁和大藥房，按人參 (用生曬參)9 g, 黃芪20 g, 熟地、 白芍各 15 g, 當(dāng)歸、 川芎各 10 g 的比例,取中藥浸泡 1 h, 文火煎煮約 1 h, 過濾并濃縮至生藥 1 g/ml，無菌分裝, 置于 4 ℃冰箱保存。CD11c、CD86、 MHC-Ⅱ等流式檢測抗體購自eBioscience公司，ELISA 檢測試劑盒購自 R&D 公司，LDH 試劑盒購自 Thermo 公司,磁珠分選系統(tǒng)購自 BD 公司。放療設(shè)備為大恒公司6MV-X線治療機。

2 研究方法

2.1 Hela細胞培養(yǎng)：人宮頸癌Hela細胞株，購自中科院細胞庫。使用含10%小牛血清的髙糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。使用接種后處于對數(shù)生長期的細胞作為實驗細胞。

2.2 小鼠宮頸癌模型的建立：取健康昆明種小鼠，復(fù)蘇傳代Hela細胞株，待Hela細胞生長至5×109/ml時胰酶消化，培養(yǎng)基終止消化，離心取沉淀，計數(shù)后調(diào)整細胞密度。采用細胞懸液皮下種植法制備荷瘤鼠模型，小鼠雙側(cè)大腿內(nèi)側(cè)皮下接種細胞懸液0.2 ml(約1×108個/ml細胞)，隔天觀察小鼠皮下宮頸癌的成瘤及生長情況，直至腫瘤大小約為5 mm×5 mm×5 mm，隨機抽取3只小鼠，取腫瘤組織行HE染色進行形態(tài)學(xué)觀察，確定荷宮頸癌小鼠模型的成功建立。

2.3 實驗分組及處理：將成功建立的荷瘤小鼠模型隨機分為對照組、圣愈湯組、放療組和圣愈湯聯(lián)合放療組，每組10只。對照組：不做治療。圣愈湯組：以圣愈湯0.4 ml灌胃，連續(xù)給藥2周。放療組：給予6MV-X線局部照射，劑量20Gy/2d，小鼠移植瘤皮膚表面予以凡士林均勻涂抹做劑量補償，其余部位予以鉛擋保護，源皮距100 cm。圣愈湯聯(lián)合放療組：圣愈湯給藥時間同圣愈湯組，局部放療時間同放射組。

2.4 流式細胞術(shù)檢測脾臟DCs的活化情況：在給藥至14 d時，取各組小鼠新鮮脾臟組織修剪成5 mm×5 mm×5 mm大小的組織塊，PBS沖洗后，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，在尼龍網(wǎng)上使用5 ml注射器柱塞行機械研磨，制成勻漿，300 μlPBS混勻；加入3倍體積的紅細胞裂解液4℃，靜置5 min；低溫離心5 min，倒掉上清液，400μlPBS重懸，調(diào)整細胞密度為1×106/ml；滴加抗體：a管為空白管，不加入任何抗體；b管為同型對照管，加入c管所加抗體等量的同種屬同型對照抗體；c管滴加不同巧光素標記的CD11c、CD86、MHC-Ⅱ抗體。震蕩器混勻，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌，離心，300 g×5 min，棄上清，低溫PBS洗涂兩次，然后200μlPBS重懸，加入流式管中，4℃避光保存；流式細胞儀檢測分析。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測脾臟細胞IFN-γ的分泌水平：治療 14 d后，取出各組小鼠脾臟，剪碎成1 cm3大小組織塊，研磨組織至勻漿狀，適量生理鹽水沖洗研磨器并收集懸液， 經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾，850轉(zhuǎn)/min離心2 min，棄上清，生理鹽水洗滌3次，離心去上清后，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液重懸，制成密度為 1×107/ml細胞懸液；再次離心取沉淀，按10倍細胞壓積的比例加入紅細胞裂解液，混合，靜置5 min后用 PBS沖洗后，以含2%FBS 的保護液重懸沉淀，加入LC分離液，離心后取中間層細胞，PBS 洗滌后重懸，使用MACS磁珠分選系統(tǒng)分離出 DCs，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后收集上清。用ELISA法檢測上清中的 IFN-γ含量，按試劑盒說明書進行操作，結(jié)果在酶標儀450 nm處檢測OD值，繪制標準曲線，計算質(zhì)量濃度，單位是pg/ml。

2.6 LDH實驗檢測脾臟細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)殺傷活性：無菌取小鼠脾臟，制備脾細胞懸液，并分離CD8+CTLs。以CD8+CTLs為效應(yīng)細胞，宮頸癌Hela細胞為靶細胞，將效應(yīng)細胞及靶細胞按20∶1比例混合，接種于培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h；PBS重懸細胞，加入細胞裂解液 4℃低溫裂解 5 min，12 000轉(zhuǎn)/min離心3 min， 取上清為細胞裂解產(chǎn)物。使用LDH 試劑盒檢測CD8+CTLs 殺傷活性 ；細胞殺傷活性計算；殺傷率(%)=(實驗組A值-效應(yīng)細胞自然釋放組A值-靶細胞自然釋放組A值)/(最大釋放組A值-靶細胞自然釋放組A值)×100%。

結(jié) 果

1 各組小鼠脾臟DCs活化情況 小鼠經(jīng)圣愈湯灌胃第7天時，圣愈湯組、放療組及圣愈湯聯(lián)合放療組脾臟活化DCs數(shù)量均較對照組升高(P<0.05),且圣愈湯聯(lián)合放療組活化DCs更高(P<0.05),見表1。

表1 脾臟DCs活化情況流式細胞測定結(jié)果

注：與對照組比較，*P<0.05；組間比較， #P<0.05

2 各組小鼠細胞因子分泌水平 圣愈湯組、放療組及圣愈湯聯(lián)合放療組INF-γ分泌量均較對照組升高(P<0.05),且圣愈湯聯(lián)合放療組INF-γ分泌量與其余各組比較更高(P<0.05),見表2。

3 圣愈湯聯(lián)合放療可明顯提高脾臟CD8+CTLs殺傷活性 圣愈湯組、放療組及圣愈湯聯(lián)合放療組脾臟CD8+CTLs殺傷均較對照組升高(P<0.05),且圣愈湯聯(lián)合放療組脾臟CD8+CTLs殺傷與其余各組比較更高(P<0.05)，見表3。

表2 各組小鼠細胞因子分泌水平

注：與對照組比較，*P<0.05；組間比較， #P<0.05

表3 各組小鼠CD8+CTLs殺傷活性檢測結(jié)果(%)

注：與對照組比較，*P<0.05；組間比較， #P<0.05

討 論

圣愈湯以補益元氣的人參和滋陰養(yǎng)血的熟地為主藥，輔以黃芪健脾益氣，白芍斂陰養(yǎng)血，當(dāng)歸、川芎補血活血，共奏益氣補血之效[4-5]。有研究表明，圣愈湯能調(diào)整免疫抑制小鼠的T細胞亞群分布及細胞因子含量，對小鼠免疫功能有一定的促進和調(diào)節(jié)作用[6-8]；本實驗在此基礎(chǔ)上，觀察圣愈湯聯(lián)合放療對荷宮頸癌小鼠脾臟DCs分泌細胞因子及CTLs對腫瘤細胞殺傷活性的影響，以進一步明確圣愈湯的免疫調(diào)節(jié)作用及其機理。

樹突狀細胞(DCs)機體重要的抗原提呈細胞，通過表達豐富的MHC分子、共刺激分子及粘附分子，刺激T細胞增殖，誘導(dǎo)抗原特異性的CTL細胞生成，從而在腫瘤免疫中起主導(dǎo)作用[9-11]。 本實驗通過流式細胞術(shù)檢測經(jīng)圣愈湯及放療干預(yù)后各組小鼠脾臟的DCs活化情況，結(jié)果表明：圣愈湯組、放療組及圣愈湯聯(lián)合放療組脾臟活化DCs數(shù)量均較對照組升高,且圣愈湯聯(lián)合放療組活化DCs更高。說明圣愈湯促進了體內(nèi)DC的分化、成熟，而放療組DCs也出現(xiàn)活化增多，則可能與放療后腫瘤細胞壞死，抗原物質(zhì)釋放后激活機體抗腫瘤免疫有關(guān)；而圣愈湯聯(lián)合放療后可放大這種腫瘤免疫反應(yīng)。

DCs細胞活化后，可將抗原提呈給CD4+T細胞，調(diào)節(jié)CD4+T細胞分化為Th1/Th2細胞，其中Th1可通過分泌多種細胞因子(如INF-γ)參與細胞免疫，具有顯著的抗腫瘤作用；同時DCs攝取抗原后，可激活CD8+T細胞，增強CTLs殺傷活性，產(chǎn)生對宮頸癌特異性的細胞毒性殺傷作用[12]；本研究結(jié)果表明：圣愈湯及圣愈湯聯(lián)合放療均能增加INF-γ的分泌，并由此促進CTLs細胞的成熟活化，增強CTLs殺傷活性；且提示聯(lián)合治療更有效激活抗原提呈細胞，增強機體的抗腫瘤免疫。

綜上所述，圣愈湯可促進荷瘤小鼠脾DC的分化、成熟，增加INF-γ分泌，誘導(dǎo)T淋巴細胞向CTLs的分化，增強CTLs殺傷活性，進而提高小鼠抗腫瘤免疫；并且圣愈湯聯(lián)合放療后，可放大其免疫促進作用；而這種免疫增強作用是否持久，能否達到穩(wěn)定的治療效果，則還需進一步的研究。