陳秋香， 劉 靜

1.長(zhǎng)沙市中醫(yī)院(長(zhǎng)沙市第八醫(yī)院)(長(zhǎng)沙 410100)；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所(北京100700)

荷葉是睡蓮科多年生水生植物蓮(Nelumbo nucifera gaertn.)的新鮮或干燥成熟葉片，常在夏、秋兩季采收[1]。蓮作為兼具藥食觀賞價(jià)值的經(jīng)濟(jì)植物，在我國(guó)廣泛種植。據(jù)統(tǒng)計(jì),蓮在我國(guó)的種植面積達(dá)500萬(wàn)畝以上，每年荷葉的采收量可達(dá)800萬(wàn)噸，資源非常豐富。在中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部的衛(wèi)監(jiān)發(fā)(1991)第45號(hào)文件中，荷葉被列入第二批“既是食品又是藥品”的名單。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為,荷葉具有清暑化濕、生發(fā)清陽(yáng)的功效，用于暑熱煩渴，暑濕泄瀉，脾虛泄瀉，血熱吐衄，便血崩漏等癥[1]，記入藥典的中藥。近年來(lái)，關(guān)于荷葉的研究不斷深入。荷葉的活性成分主要是荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿、N-去氫荷葉堿、O-去氫荷葉堿等生物堿以及蘆丁、金絲桃苷等黃酮類(lèi)化合物，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抑菌[2]、抗氧化[3]、調(diào)節(jié)血脂[4]等作用。刑毅[5]研究發(fā)現(xiàn)荷葉提取物能夠降低小鼠血清 TC、TG、LDL-C 的水平，且高劑量下對(duì)其水平的改善與血脂膠囊相當(dāng)，表明荷葉提取物具有降低血脂的功效。荷葉中的生物堿可通過(guò)活化AMPK信息通路，改善成熟脂肪細(xì)胞的糖脂代謝，從而產(chǎn)生調(diào)脂減肥的生理作用[6]。目前對(duì)荷葉的初步開(kāi)發(fā)主要有茶劑、煎劑和膠囊等。隨著時(shí)代的不斷發(fā)展，健康逐漸成為關(guān)注的重點(diǎn)，具有減肥降脂功能的荷葉茶的研究逐漸成為熱點(diǎn)，荷葉功能茶飲料[7]、荷葉降脂茶飲料、菊粉荷葉茶飲料等應(yīng)運(yùn)而生。由于荷葉潛在的臨床和市場(chǎng)價(jià)值，成熟荷葉葉片在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中被用于肥胖、高血脂癥和高血壓等的治療，已成為開(kāi)發(fā)天然、安全、特效減肥藥品最具潛力的首選藥材之一[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)擬用一定的方法處理新鮮荷葉，獲得荷葉茶產(chǎn)品，并通過(guò)高效液相色譜法分析荷葉中主要的活性成分——黃酮類(lèi)和生物堿類(lèi)成分，考察制茶工藝的穩(wěn)定性。同時(shí)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以荷葉堿與總黃酮成分為指標(biāo)，確定荷葉茶的最佳浸提工藝，為荷葉茶作為綠色、健康的茶飲研究夯實(shí)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 主要儀器與試藥 RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)；色譜柱Sunfire C18柱、Xbridge Amide C18柱(沃特世，美國(guó))；AEQ-120電子天平：島津；1290-HPLC：安捷倫(安捷倫，美國(guó))；標(biāo)準(zhǔn)品荷葉堿、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷均來(lái)自安普公司；濾器0.22um安普公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(長(zhǎng)沙醫(yī)療機(jī)械廠)；鮮荷葉：采用福建子蓮產(chǎn)區(qū)新鮮荷葉。

2 研究方法

2.1 荷葉茶制作工藝：新鮮荷葉先切碎后用130℃微波殺青，碾磨后在150℃ 干燥5 min左右，逐步降溫到130℃干燥5 min，100℃干燥5 min，即得荷葉茶。

2.2 黃酮和生物堿含量測(cè)定的色譜條件

2.2.1 黃酮化合物含量測(cè)定色譜條件：利用 Sunfire C18(150 nm×4.6 nm，3.5μm)色譜柱，在350 nm波長(zhǎng)下，參照Chen et a[10]報(bào)道的色譜條件，流動(dòng)相A為0.5%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫(0～10 min，12% B；10～32 min，12%～20% B；32～40 min，20%～30% B；40～48 min，30%～60% B；48～49 min，60%～12% B；49～53 min，12%)，流速0.6 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣的體積為10 μl。

2.2.2 生物堿化合物含量測(cè)定色譜條件：利用Xbridge Amide C18(250 nm×4.6 nm，5 μm)色譜柱，在272 nm波長(zhǎng)下，參照 Chen AD.[11]報(bào)道的色譜條件，流動(dòng)相A為0.1%三乙胺，B為乙腈，梯度洗脫(0～15 min，40%～80% B；15～18 min，80% B；18～19 min，80%～40% B；19～22 min，40% B)，流速0.8 ml/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μl。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精密稱(chēng)定金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷以及荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品，分別用純化水稀釋成六種適當(dāng)?shù)牟煌瑵舛?，參?.2 黃酮和生物堿含量測(cè)定的色譜條件分別進(jìn)行含量測(cè)定。每個(gè)濃度測(cè)量3次，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度值為縱坐標(biāo)，平均峰面積為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 高效液相色譜法檢測(cè)荷葉茶中黃酮和生物堿的含量：參照2.2 黃酮和生物堿含量測(cè)定的色譜條件對(duì)荷葉茶進(jìn)行含量測(cè)定。

2.5 正交試驗(yàn)

2.5.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：荷葉茶采用100℃沸水進(jìn)行浸提，設(shè)置茶水比(A)、浸提次數(shù)(B)、浸提時(shí)間(C)3個(gè)因素，茶水比分別為30∶1，50∶1和80∶1，分別浸提1次，2次和3次，每次時(shí)間分別為10 min、30 min和60 min各三個(gè)水平。采用 L9(34)正交表設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳浸提工藝。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 浸提因素和水平考察

2.5.2 正交試驗(yàn)與含量測(cè)定：精密稱(chēng)定荷葉茶1 g，按L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行浸取實(shí)驗(yàn)。浸取完畢后，過(guò)濾，合并濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至一定程度后，將濃縮液置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干。取純化水2 ml溶解殘?jiān)鳛楣┰嚻啡芤骸Ｆ叫?次，按標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定方法進(jìn)行含量測(cè)定。

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)：精密稱(chēng)定荷葉茶1 g，按正交試驗(yàn)結(jié)果確定的工藝條件茶水比為50∶1，浸提2次，每次30 min，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。共檢測(cè)3批次樣品，測(cè)荷葉堿與總黃酮含量。

結(jié) 果

1 高效液相色譜法檢測(cè)荷葉茶中黃酮和生物堿含量 用液相色譜法檢測(cè)到荷葉茶中含有的黃酮和生物堿含量結(jié)果見(jiàn)圖1和表2。圖1為黃酮類(lèi)化合物在液相上350 nm下的紫外吸收?qǐng)D和生物堿類(lèi)化合物在液相上272 nm下的紫外吸收?qǐng)D，圖中化合物的含量與表2是一致的。這一結(jié)果表明，鮮荷葉中活性黃酮類(lèi)和生物堿類(lèi)的成分都得到了很好的保留，荷葉茶制作工藝可行。

圖1 荷葉茶中黃酮類(lèi)化合物和生物堿類(lèi)化合物的紫外吸收?qǐng)D

2 正交試驗(yàn)與含量測(cè)定結(jié)果 按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值為正交試驗(yàn)的結(jié)果值，表3。

3 試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析 對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行直觀分析，得到表4。由表4可知，總黃酮含量項(xiàng)下RA>RB>RC，即影響總黃酮含量的因素程度為A>B>C，說(shuō)明茶水比是影響浸提總黃酮的最主要因素，浸提時(shí)間影響較小。生物堿含量項(xiàng)下RC>RB>RA，即影響生物堿含量的因素程度為C>B>A，表明浸提時(shí)間是影響浸提生物堿的最主要因素，茶水比影響較小。總黃酮含量與生物堿含量項(xiàng)下，各因素的K2值均大于K1和K3，反映各因素在水平2條件下，對(duì)浸提結(jié)果作用最大。故荷葉茶的最佳浸提工藝應(yīng)為A2B2C2，既茶水比為50∶1，浸提2次，每次30 min。Ki=∑χi/3，Rχ=Kmax- Kminχ為因素i的水平。

表2 荷葉茶中黃酮類(lèi)和生物堿類(lèi)化合物的含量

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 取3個(gè)批次荷葉茶，按最佳浸提工藝測(cè)得荷葉堿含量依次為467.44 μg/g、477.81 μg/g、472.64 μg/g，總黃酮含量依次為7088.12 μg/g、6967.45 μg/g、7007.39 μg/g。3個(gè)批次總黃酮含量均值為7020.99 μg/g，RSD值為0.88%；生物堿含量均值為472.63 μg/g，RSD值為1.10%，總黃酮與生物堿的含量與正交初步篩選出來(lái)的浸提工藝A2B2C2的試驗(yàn)結(jié)果僅有微小差別，表明優(yōu)選出的浸提工藝穩(wěn)定且提取效果佳，適合荷葉茶的浸提。

表4 正交試驗(yàn)直觀分析

討 論

荷葉具有降血脂作用，將荷葉與黑茶組方后，不僅可以明顯改善內(nèi)生濕熱證患者的濕熱內(nèi)蘊(yùn)癥候表現(xiàn)、高血壓狀態(tài)、降低甘油三酯、提高HDL-C、改善胰島素抵抗的功效，同時(shí)還可以降低炎癥因子TNF-a、IL-1和腫瘤相關(guān)指標(biāo)，并可能對(duì)預(yù)防飲食相關(guān)的腫瘤有一定的作用[12]近年發(fā)現(xiàn)荷葉還具有抑制脂肪肝，抗動(dòng)脈硬化、保護(hù)心血管，抗病毒、保肝、抗纖維化等藥理活性[8]。有的藥理作用還沒(méi)有被充分利用，大多用于復(fù)方制劑中，其原因是：操作程序沒(méi)有規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，使質(zhì)量不能得到有效的控制[13]。微波殺青工藝制作的荷葉茶，能夠很好地保留荷葉中的各種活性黃酮和生物堿類(lèi)成分。

荷葉是一種常見(jiàn)的藥食同源中藥，在我國(guó)分布廣泛,資源豐富，價(jià)格低廉，但大部分都自然凋零廢棄在田地中，沒(méi)有有效的利用起來(lái)，造成了資源的極大浪費(fèi)。不僅如此，廢棄的荷葉可能會(huì)污染河道，降低水質(zhì)，致使荷塘沼澤化，不利于生態(tài)的健康可持續(xù)發(fā)展。將荷葉制作成保健茶的方式，使用和貯藏方便、簡(jiǎn)單，用藥依從性好，能促進(jìn)中藥資源更好地開(kāi)發(fā)利用。100°C沸水常用于泡茶，所以,本試驗(yàn)利用其作為荷葉茶的浸提溶劑，更具實(shí)用性。

生物堿和黃酮類(lèi)化合物是荷葉的主要活性成分，荷葉堿為荷葉中最主要的生物堿[14-15]，其亦是中藥荷葉質(zhì)量的重要考察指標(biāo)[16-17]。金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷是荷葉黃酮類(lèi)化合物的主要成分[1]，故以其總含量作為總黃酮含量考察具有代表性。下一步實(shí)驗(yàn)將涉及對(duì)荷葉有效成分的毒副反應(yīng)及藥效評(píng)價(jià)的研究。

目前荷葉茶品種單一，檔次低下，荷葉資源有待充分挖掘和利用。通過(guò)優(yōu)化荷葉的提取工藝，革新荷葉茶的制作工藝，豐富荷葉茶的品種，增強(qiáng)荷葉茶的感官品質(zhì)和穩(wěn)定性，為荷葉茶制作標(biāo)準(zhǔn)的制定和有效利用荷葉資源提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)荷葉茶的深加工與后續(xù)研究甚至周邊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，具有重要的價(jià)值。