郭 綺

(重慶市藥品技術審評認證中心，重慶 401120)

臨床檢驗中對患者樣本一般進行一次測量，體外診斷(IVD)試劑的精密度符合要求才能保證臨床結果的準確性，好的精密度是獲得良好準確度的先決條件[1]。精密度主要由測量過程中的隨機誤差和一些變異因素(如試劑批次、校準周期、校準品批次、儀器、操作者等)所引起，針對不同的引起精密度變化的因素進行考察，可得到不同類型的精密度，如批內(nèi)精密度、批間精密度等[2-3]。精密度是IVD試劑、儀器的重要分析性能之一，是產(chǎn)品研發(fā)、產(chǎn)品標準制訂、產(chǎn)品注冊等過程的重要技術指標，其評價資料是評價擬上市產(chǎn)品有效性的重要依據(jù)，也是產(chǎn)品注冊所需的重要申報資料之一[3-4]。所以精密度在IVD定量檢測產(chǎn)品研發(fā)階段就應該受到廠家研發(fā)人員的重視。

精密度作為檢驗項目分析性能參數(shù)中最重要的性能指標之一同時也是醫(yī)學實驗室ISO 15189質(zhì)量管理體系要求的項目，受到臨床實驗室的高度重視[5]。目前，國內(nèi)臨床實驗室主要依據(jù)WS/T 492-2016 《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》標準進行評價[4]，該標準主要依據(jù)CLSI EP 15-A文件[4,6]。隨著近幾年國內(nèi)IVD行業(yè)的迅速發(fā)展以及臨床實驗室對IVD定量檢測產(chǎn)品精密度驗證活動的不斷實踐和加深認識[7]，國家審評中心、行業(yè)、臨床實驗室對IVD定量檢測產(chǎn)品的質(zhì)量要求也在不斷提高。筆者依據(jù)新版美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI) EP15-A3文件“用戶對精密度驗證和偏倚評估”，編制了臨床實驗室定量測量項目精密度驗證程序，旨在為臨床實驗室IVD定量檢測產(chǎn)品精密度驗證的實施提供參考。

1 精密度驗證方法

1.1方法簡介 實驗主要是在5個工作日內(nèi)重復檢測同一批樣本，共5次。如需要達到更可靠的穩(wěn)定性，則建議增加實驗時間[6]。

1.2準備工作

1.2.1熟悉期 (1)人員培訓:工作人員應學會儀器操作，維護程序，樣本準備方法，測量系統(tǒng)校準和校準驗證功能，必要時由廠家提供培訓。(2)質(zhì)控程序：在熟悉期就應該建立該方法的質(zhì)控程序。根據(jù)廠家說明書，確認儀器操作在控，可使用廠家推薦的質(zhì)控方法，但不應該使用廠家建立的不精密度來建立質(zhì)控范圍。關于質(zhì)控程序的建立，可以參考CLSI C24文件。(3)實驗記錄:實驗應記錄的內(nèi)容包括儀器名稱和檢測信息(分析物種類、數(shù)量、單位)、試劑和校準品批號、選擇某測量濃度的理由、樣本信息(組成、不確定度等)、精密度聲明的來源(通常是廠家的藥品說明書里的表格)、實驗所用的軟件工具以及它們的版本號、檢測數(shù)據(jù)回顧和數(shù)據(jù)處理的個人責任、實驗設計和延期的任何決定。(4)數(shù)據(jù)處理方法:當選定了一種數(shù)據(jù)處理的方法后，應注意一些潛在的誤差來源：如每一個計算步驟的公式轉(zhuǎn)變需要額外校對，合理進行有效數(shù)字的取舍，注意表格的完整性和公式的正確性等。

1.2.2設備和環(huán)境要求 所有用于精密度驗證實驗的設備均應在使用前核查是否處于受控狀態(tài)，在設備運行期間應保持實驗室內(nèi)環(huán)境始終處于受控狀態(tài)，無空氣污染，通風足夠，如每小時至少換氣6次(尤其是有機械通風裝置的房間內(nèi))。

1.2.3實驗室要求 需有足夠時間開啟和運行儀器以確保操作者理解儀器的全部步驟并能正確操作。

1.3實驗設計

1.3.1時間、批次及重復次數(shù) 基本的5×5設計：要求至少檢測2個不同濃度樣本，至少檢測5 d(可以不連續(xù))，每天1批，每批重復測量5次。實驗結束后每個樣本總共得到25個結果[6]。為獲得更可靠的精密度驗證數(shù)據(jù)，可以將檢測時間增加為7 d。

1.3.2樣本 (1)樣本選擇:應至少選擇2個樣本，最好是患者血清或混合血清，或者商業(yè)性的質(zhì)控材料，盡量與廠家建立精密度聲明時所用材料一致[8-10]。(2)濃度選擇：樣本應有不同的檢測濃度，最好有一個代表了臨床決定值(臨界值)或參考限附近，或簡單地落在正常和異常范圍。應避免使用極高、極低濃度樣本[11]，因為它超出了廠家說明書的水平范圍，需要外推計算，或者得到的結果可能會超出某些重復檢測范圍。(3)樣本保存：應注意樣本儲存條件，保證整個實驗期間樣本的穩(wěn)定性，降低因樣本不穩(wěn)定帶來的精密度影響。習慣做法是能整個使用和解凍的樣本，以方便檢測。在決定樣本體積和數(shù)量的時候，要注意無效腔以及有可能要用到的額外批次的檢測。(4)樣本處理：應嚴格按照要求進行樣本處理，避免不同操作者帶來的差異，樣本處理過程要與廠家建立精密度聲明時所做的保持一致；不同濃度樣本可以在不同天或不同批內(nèi)檢測完畢，檢測時需先做質(zhì)控，質(zhì)控在控時結果可以接受，如失控需查明原因，拒絕所有檢測結果，缺失的結果需額外補齊。

2 精密度驗證實驗流程

精密度驗證實驗給用戶提供了精密度性能驗證的指引和方法。為了區(qū)分廠家的不精密度聲明和用戶的不精密度驗證值，本文分別用σR、σWL表示廠家聲明的重復性和實驗室內(nèi)不精密度，用SR、SWL表示用戶驗證的重復性和實驗室內(nèi)不精密度。通常，廠家有兩種精密度聲明——重復性(批內(nèi)不精密度) 和實驗室內(nèi)不精密度[10]。本部分內(nèi)容提供了從這兩種聲明中識別總變異的統(tǒng)計學方法。圖1為樣本的(重復性和實驗室內(nèi))不精密度的驗證和分析圖。

圖1 樣本精密度(重復性和實驗室內(nèi))驗證分析圖

3 數(shù)據(jù)分析

3.1測量數(shù)據(jù)判斷

3.1.1數(shù)據(jù)完整性判斷 每天都應檢查所有結果，如果由于檢測系統(tǒng)或室內(nèi)質(zhì)控導致需要拒絕該批結果，應及時查找原因補充數(shù)據(jù)。

3.1.2各樣本數(shù)據(jù)分析 注意：本文內(nèi)容假設用戶實驗時使用最基本的5×5設計，也可多1～2個批次，可使用單因素ANOVA軟件進行分析。按照5×5設計進行試驗得到的總膽紅素結果，見表1。表中總膽紅素檢測結果無缺失值，根據(jù)Grubb′s法25個結果中無離群值[6]，具體分析：計算所有結果的平均值和標準差(SD)，Grubbs′因子G(取決于N，當數(shù)據(jù)是平衡無缺失時N=25，G一般為3.135，n0則為5)[6]。也可以根據(jù)《數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和解釋 正態(tài)樣本離群值的判斷和處理其他方法》進行離群值判斷[12]?？偰懠t素所有結果均值為18.8和0.22 μmol/L，Grubbs′范圍的上、下限計算：Grubbs′限值=均值±G·SD=18.8±3.135×0.22=18.1或19.5 μmol/L。表1中數(shù)據(jù)均在該范圍內(nèi)，所以無離群值。

表1 總膽紅素精密度驗證原始數(shù)據(jù)(μmol/L)

3.2不精密度實驗數(shù)據(jù)的單因素方差分析 精密度驗證的實驗數(shù)據(jù)使用單因素方差分析方法，可借助相關統(tǒng)計軟件來進行，以表1中總膽紅素分析結果為例，其統(tǒng)計結果輸出如表2所示。

表2 總膽紅素單因素方差分析的輸出結果

注：-表示該項無數(shù)據(jù)

重復性CVR=0.80%，實驗室批間變異CVB=0.90%，實驗室內(nèi)不精密度CVWL=1.22%。

4 用戶獲得的不精密度與廠家的聲明進行比較

驗證實驗完成每個樣本的重復性和實驗室內(nèi)不精密度的計算后，用戶應檢查獲得的不精密度與廠家聲明的是否一致，可將結果直接與廠家聲明進行比較，如一致則驗證通過[14-15]；如不一致則需進行相關的上限值(UVL)計算，必要時可聯(lián)系廠家。仍以表1中總膽紅素數(shù)據(jù)為例，經(jīng)統(tǒng)計分析總膽紅素的CVR=0.80%，CVB=0.90%，CVWL=1.22%，分別與廠家聲明的精密度(見表3)進行比較。表1中總膽紅素濃度為18.8 μmol/L，與廠家聲明的第一個濃度相近，重復性為0.80，小于廠家聲明的2.7%；實驗室內(nèi)不精密度為1.22%，小于廠家聲明的4.66%，驗證通過。

為了降低由于單獨機會性導致的確證廠家精密度聲明的失敗，可以計算廠家聲明的UVL。UVL表示當廠家聲明正確時，從相同樣本量和相同實驗設計方案的用戶精密度實驗中獲得不精密度估計的95%上限，是不精密度確證實驗是否接受的判斷標準。用戶寧可使用UVL也不單獨使用廠家聲明，這樣可以避免由于機會性引起的不恰當?shù)尿炞C失敗，使驗證試驗成功率至少提高5%。

對于某給定標本，只有在用戶的重復性估計值小于或等于廠家的聲明(若失敗，必須小于或等于廠家聲明的相關UVL)的時候，才能說用戶觀察到某濃度樣本的重復性與廠家聲明一致。由于 UVL經(jīng)常大于相關的聲明，用戶的估計值通常至少大于廠家的聲明30%，仍然算通過。

如果用戶的估計值超出了廠家聲明，用戶應將得到的估計值與聲明的UVL比較，以總膽紅素精密度驗證為例?？偰懠t素廠家精密度聲明1、2、3的均值分別為20.6、80.3、160.8 μmol/L。通過下列三步計算 UVLs[6]。(1)計算自由度df，用于尚在疑問中的不精密度估計(dfR是重復性的不精密度，dfWL是實驗室內(nèi)不精密度)。(2)從EP15-A3文件中查得UVL的F因子。(3)利用UVL的F因子計算UVL和廠家的聲明。將用戶的不精密度與UVL進行比較。對于重復性比較，計算重復性的自由度dfR。dfR=N-k，N是結果的總數(shù)目，k是檢測批次的數(shù)目。對于實驗室內(nèi)不精密度比較，首先計算聲明的比率ρ：ρ=σWL/σR=%CVWL/%CVR，ρ是用廠家的實驗室內(nèi)不精密度聲明除以廠家的重復性聲明，可以用SD表示，也可以用CV表示。然后從EP15-A3中得到大概的自由度，dfWL。見表3。

表3 總膽紅素廠家不同精密度聲明的UVLs計算

5 結果解釋

精密度驗證所有數(shù)據(jù)分析和一致性檢驗完成后，用戶擁有：(1)實驗中每個測試樣本的“重復性”和“實驗室內(nèi)不精密度的估計值”。(2)一致性檢驗結果(通過或失敗)。

用戶還應檢查一致性檢驗結果是否覆蓋精密度確認實驗的所有樣本濃度范圍。如果所有結果都在確認范圍內(nèi)，則用戶的精密度與廠家的聲明一致(注：由于樣本數(shù)量有限，統(tǒng)計結果有可能接受了錯誤的通過和錯誤的失敗)。精密度驗證實驗完成后，可能會有以下3種情況。情況1A：所有估計值都通過，接近或低于廠家聲明或 UVLs，證明用戶實驗室的不精密度與廠家聲明具有可比性。情況1B：所有估計值通過，但有些勉強通過，該情況表明用戶實驗室所有結果，或者部分檢測范圍內(nèi)結果的不精密度可能超出廠家聲明?？傮w來講該實驗在統(tǒng)計學上還是與廠家聲明一致。情況2：大多數(shù)估計值通過，但有些沒通過。實驗負責人應回顧實驗，判斷該檢驗程序的不精密度是否與廠家的聲明完全不符，該檢驗程序是否仍可接受使用。如可接受使用，人應詳細闡述接受的理由，并監(jiān)控日常質(zhì)控的不精密度。情況3：好幾個估計值均未通過，實驗總體與廠家聲明不一致。用戶可以有3個選擇：(1)完全拒絕該檢驗程序；(2)尋找故障，比如說在廠家?guī)椭拢貜驼麄€精密度驗證實驗；(3)為確定該檢驗程序精密度性能特征，做天數(shù)和次數(shù)更多的實驗驗證。

6 注意事項

成功完成精密度驗證實驗后，用戶可以將該檢驗程序投入使用。使用過程中，室內(nèi)質(zhì)控作為實驗室不精密度的主要反映，通過長時間監(jiān)控日常質(zhì)控樣本收集到的統(tǒng)計資料更能代表實驗室內(nèi)不精密度[8]。但如果出現(xiàn)試劑或定標物批號的改變，儀器維修、試劑穩(wěn)定性改變、實驗環(huán)境因素變化、新操作者或分析前因素的影響等情況時，日常質(zhì)控結果得到的不精密度值可能會超出廠家聲明，用戶應充分考慮并排除或降低這些變異因素。

如果用戶“實驗室內(nèi)精密度”聲明通過，但“重復性”聲明沒有通過，則反映了實驗中“批”的差異。如廠家是通過雙份檢測得到，而用戶的實驗設計可能包含了更長的時間范圍。

本文假設廠家的精密度聲明準確地代表了檢測方法目前的性能，也假設了廠家的聲明是沒有特別明顯的不確定度。表格列出了跟不確定度相關的不精密度統(tǒng)計資料，但廠家聲明的精密度實驗可能不那么嚴謹，包括檢測天數(shù)也達不到經(jīng)典的CLSI文件EP05的實驗設計[13]；對于某給定濃度和精密度類型，當用戶的精密度既沒有落入可允許變異范圍也超出了廠家聲明計算出來的UVL的時候，用廠家聲明會比用臨床可允許變異范圍要好得多。這種情況下，即使精密度驗證實驗沒有通過廠家聲明，用戶也可選擇接受檢測方法的精密度性能。