張文煥, 劉平香, 邱 靜, 賈 琪, 錢永忠

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室, 北京 100081)

生姜是人們?nèi)粘Ｉ钪械闹匾{(diào)味品之一,在我國及世界各地均有廣泛種植,其品種多樣,具有特殊的營養(yǎng)保健功效,是“藥食同源”的典型代表[1]。生姜中的姜辣素類化合物是其特殊辛辣味的主要來源,它們是一類結(jié)構(gòu)、性質(zhì)類似的物質(zhì),其中含量最高的是姜酚類物質(zhì),包括6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚等,還含有少量6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚等姜烯酚類物質(zhì)。從結(jié)構(gòu)上看,它們都有3-甲氧基-4-羥基苯基官能團,姜酚類化合物中還有性質(zhì)活潑的β-羥基酮結(jié)構(gòu),這使得生姜具有較強的生物活性[2-4]。研究表明,姜烯酚比姜酚更辛辣,且生物活性更高[5]。生姜中的姜黃素類化合物是其重要的呈色物質(zhì),如姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素,它們是自然界中稀有的二酮類天然色素,廣泛存在于姜科類植物中[6]。研究表明,包括四氫姜黃素在內(nèi)的姜黃素類化合物同樣具有顯著的生物活性,有報道指出四氫姜黃素的生物活性優(yōu)于姜黃素[7]。此外,生姜中還存在一類揮發(fā)性精油物質(zhì),它們在鮮姜中含量豐富、種類繁多,一同決定了生姜的氣味[8],而香氣成分容易揮發(fā),結(jié)合生姜的儲藏特性和食用特性,生姜的特征營養(yǎng)成分當(dāng)以姜辣素類和姜黃素類物質(zhì)為主。大量研究表明,由于生物活性物質(zhì)的存在,生姜不僅有抗菌、鎮(zhèn)痛、止嘔、止暈、抗炎、抗癌、抗氧化、降血糖血脂等重要生理作用,還可用于研制治療心腦血管疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胃潰瘍等疾病的藥物和保健食品[9-13]。

生姜品質(zhì)主要取決于其含特征營養(yǎng)成分的量,在多國藥典中已將6-姜酚的含量作為評價生姜質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一[14]。近年來,生姜中化學(xué)成分的測定方法已有較多報道,針對營養(yǎng)成分的檢測大多是針對某一物質(zhì)或某一類物質(zhì)開展的,如Park等[15]采用高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(HPLC-TOF/MS)方法對生姜中姜辣素類化合物進行了定性篩查和定量測定,并在60 min內(nèi)鑒定19種姜辣素類化合物,其中6-姜酚含量最高,10-姜酚、8-姜酚次之;Jadhav等[16]和Jayaprakasha等[17]分別建立了HPLC方法對3種姜黃素類化合物同時測定。然而,同時檢測兩類營養(yǎng)成分的方法未見報道。鑒于生姜中姜辣素類和姜黃素類化合物具有相似的結(jié)構(gòu)特征和功能活性,有必要建立一種同步、快速測定二者的分析方法。

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)對生姜中含量較高、活性較強的6種姜辣素類化合物和4種姜黃素類化合物進行了測定,以期在實際樣品的檢測中得以應(yīng)用,并為進一步研究生姜中營養(yǎng)成分的變化規(guī)律、品質(zhì)鑒別及資源開發(fā)利用提供必要的技術(shù)手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(包括Agilent 1290 InfinityⅡ高效液相色譜儀和Agilent 6470 Triple Quad LC/MS三重四極桿質(zhì)譜儀,美國Agilent公司); Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司); E0301平行研磨儀(中國天津阿爾塔科技有限公司); XSE105 Dual Range分析電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司); SCDEALL VX-Ⅲ Multi-Tube Vortexer多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司);甲醇和乙腈(質(zhì)譜級,德國Merck公司);甲酸(質(zhì)譜級,美國Sigma-Aldrich公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品:6-姜酚(6-gingerol, CAS號:23513-14-6,純度98.9%)、8-姜酚(8-gingerol, CAS號:23513-08-8,純度99.5%)、10-姜酚(10-gingerol, CAS號:23513-15-7,純度97.5%)、6-姜烯酚(6-shogaol, CAS號:555-66-8,純度97.6%)、8-姜烯酚(8-shogaol, CAS號:36700-45-5,純度98.3%)、10-姜烯酚(10-shogaol, CAS號:36752-54-2,純度98.1%)、四氫姜黃素(tetrahydrocurcumin, CAS號:36062-04-1,純度99.7%)、姜黃素(curcumin, CAS號:458-37-7,純度98.9%)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin, CAS號:22608-11-3,純度98.0%)、雙去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin, CAS號:24939-16-0,純度98.0%),均購于天津阿爾塔科技有限公司。10種標(biāo)準(zhǔn)品的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖 1 10種營養(yǎng)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of the 10 nutrients

實驗用生姜樣品采自山東省各生姜基地,收獲期均為2018年11月。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取5.0 mg 10種營養(yǎng)成分標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.1 mg),用甲醇定容至5 mL,配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃冰箱儲藏,備用。

吸取適當(dāng)體積的各標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,用甲醇稀釋,配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,于-20 ℃冰箱儲藏,備用。

用甲醇稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,配制成質(zhì)量濃度為0.10～200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

表 1 10種營養(yǎng)成分的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 樣品預(yù)處理、前處理

預(yù)處理:選取形態(tài)完整、質(zhì)量約200 g的塊狀生姜根莖作為實驗樣品,去除泥土,用水洗凈,拭干表面;不去皮切成小塊,裝入研磨杯,使用平行研磨儀充分研磨,然后轉(zhuǎn)移至塑封袋中,于-20 ℃保存,待用。

前處理:稱取(500±0.5) mg生姜樣品的均一研磨物,置于50 mL具塞離心管中,加入25 mL甲醇,封蓋,渦旋10 s,短暫混合,置于渦旋振蕩器,提取2 min,靜置10 min,取1 mL上清液,過0.2 μm有機濾膜。由于樣品中某些營養(yǎng)成分含量非常高,需用甲醇逐級稀釋配制成不同稀釋倍數(shù)的系列樣品溶液,以備上機測定。

1.4 色譜條件

色譜柱:ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:30 ℃;流動相:A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 5%B; 1.0～2.5 min, 5%B～40%B; 2.5～4.5 min, 40%B～85%B; 4.5～4.6 min, 85%B～5%B; 4.6～5.5 min, 5%B。進樣量:2.0 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源:噴射流離子聚焦-電噴霧電離(Jet Stream ESI)源;離子模式:正離子模式;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;鞘氣溫度和流速:250 ℃和11.0 L/min;噴嘴電壓:500 V;毛細(xì)管電壓:4 000 V;霧化氣壓力:0.31 MPa;干燥氣溫度和流速:300 ℃和5 L/min;以上干燥氣、霧化氣、碰撞氣、鞘氣均為高純氮氣(N2)。

10種營養(yǎng)成分的監(jiān)測離子對信息、碎裂電壓(fragmentor)和碰撞能(collision energy)等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 (續(xù))

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用了噴射流離子聚焦-電噴霧電離源,該技術(shù)通過加熱鞘氣加速溶劑蒸發(fā)并降低離子逸散,從而提高離子生成及傳輸效率,增強質(zhì)譜的離子采樣率,獲得更好的檢測靈敏度。在電噴霧電離條件下,采用正離子模式使目標(biāo)分子較易獲得1個質(zhì)子,從而形成穩(wěn)定的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰。

分別采用100 μg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液上機分析，確認(rèn)每種目標(biāo)營養(yǎng)成分的母離子和子離子。選擇一級質(zhì)譜全掃描模式尋找母離子;選擇離子監(jiān)測模式優(yōu)化出母離子響應(yīng)最佳時的碎裂電壓,以保證母離子的傳輸效率;選擇子離子掃描模式進行二級質(zhì)譜全掃描,尋找響應(yīng)最好的2～3個子離子,同時優(yōu)化每個子離子響應(yīng)較高的碰撞能;最后選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描,對碰撞能進一步優(yōu)化,得到子離子響應(yīng)最佳時的碰撞能。

其中值得注意的是,歐盟方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)對質(zhì)譜方法定性確證的要求是滿足最低“4分法”,以每個母離子為1分,每個子離子為1.5分計[18],因此對LC-MS/MS而言,需至少有2對離子對方可實現(xiàn)對目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性。在選擇子離子時,排除了相對分子質(zhì)量小于50的離子以及中性丟失離子(如脫水離子)。在完成了母離子和子離子確認(rèn)以后,采用自動優(yōu)化程序和手動優(yōu)化程序同時確證優(yōu)化出最優(yōu)的碎裂電壓與碰撞能。

10種目標(biāo)營養(yǎng)成分的分子結(jié)構(gòu)具有一定的相似性,如3種姜酚均具有典型的β-羥基酮結(jié)構(gòu),由電離結(jié)果發(fā)現(xiàn),相似結(jié)構(gòu)特征所產(chǎn)生的離子碎片呈現(xiàn)出一定的碎裂規(guī)律,如3種姜酚及四氫姜黃素均可產(chǎn)生信號較強的m/z為177.1和137.1的碎片離子峰,3種姜烯酚均可產(chǎn)生信號較強的m/z為137.1和m/z122.1的碎片離子峰,去甲氧基姜黃素及雙去甲氧基姜黃素均可產(chǎn)生m/z為147.0的碎片離子峰。在4種姜黃素類營養(yǎng)成分中僅四氫姜黃素能夠產(chǎn)生信號較強的m/z為137.1的碎片離子峰,同時僅雙去甲氧基姜黃素未能產(chǎn)生m/z為177.1的碎片離子峰。由此分析可知,可以通過選擇恰當(dāng)?shù)奶卣麟x子碎片從而鑒別推斷各物質(zhì)的裂解規(guī)律,還可為生姜中更多具有相似結(jié)構(gòu)功能的化合物的發(fā)現(xiàn)提供一定依據(jù)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

液相色譜條件影響目標(biāo)化合物的離子化效率,影響其色譜峰分離行為與峰形,為獲得理想的色譜分離效果和更高的檢測靈敏度與準(zhǔn)確性,實驗對流動相組成、柱溫以及梯度洗脫程序進行了優(yōu)化。選用常見的甲醇-水體系和乙腈-水體系作為流動相進行考察,發(fā)現(xiàn)在兩種流動相體系下各目標(biāo)化合物均能出峰,但在甲醇-水體系下表現(xiàn)出更高的響應(yīng),故采用了甲醇-水體系。結(jié)合10種目標(biāo)化合物具有較強極性的結(jié)構(gòu)特點,在流動相中分別添加0.1%(v/v)甲酸有利于改善峰形。為使10種營養(yǎng)成分實現(xiàn)良好分離,采用梯度洗脫不斷調(diào)節(jié)流動相各部分比例,使得在1.4節(jié)梯度條件下,各目標(biāo)物的色譜峰在5.5 min內(nèi)實現(xiàn)較好分離。10種營養(yǎng)成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L)的總離子流色譜圖見圖2。

圖 2 10種營養(yǎng)成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L)的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatograms of the 10 nutrients (50 μg/L) in the mixed standard solution

2.3 線性關(guān)系、檢出限和定量限

將10種營養(yǎng)成分的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋配制成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0和200.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,以各營養(yǎng)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X, μg/L),色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,進行線性回歸分析并計算相關(guān)系數(shù)(r),結(jié)果見表2。這10種營養(yǎng)成分的r為0.999 5～0.999 9,說明其線性關(guān)系良好,滿足檢測要求。

表 2 10種營養(yǎng)成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

由于生姜樣品中本身含有待測物,且其中一些成分的本底值很高,因此不能獲得空白基質(zhì)。對目標(biāo)物檢測并計算信噪比(S/N)值,得出S/N均大于10,說明生姜中各目標(biāo)物含量高于分析方法的定量限?？紤]到實際應(yīng)用中可能出現(xiàn)目標(biāo)物含量接近或低于方法定量限等情況,故對方法的檢出限和定量限作進一步考察。將待測試樣稀釋100倍、1 000倍后,再檢測并計算S/N,以S/N大于3和大于10(同時符合回收率和精密度要求)確定10種目標(biāo)物的檢出限和定量限,二者分別為0.04～2.02 μg/L和0.10～7.71 μg/L。10種營養(yǎng)成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限見表2。

2.4 回收率和精密度

由于生姜本身含有待測營養(yǎng)成分,無法得到空白基質(zhì)樣品,為考察檢測方法的準(zhǔn)確度和精密度,采用樣品加標(biāo)回收法進行評價。取同一樣品的子樣兩份,一份不加標(biāo),另一份加入適量的10種營養(yǎng)成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3節(jié)和1.4節(jié)處理并上機測定,以二者測定結(jié)果的差值與理論加標(biāo)值之比計算回收率。

因?qū)嶋H樣品中各營養(yǎng)成分的含量水平不一,需先明確各營養(yǎng)成分適合的樣品溶液稀釋倍數(shù)以及該稀釋倍數(shù)下的基質(zhì)背景值,保證加標(biāo)的量值與基質(zhì)背景值接近,且不加標(biāo)樣品與加標(biāo)樣品的測定值都在線性范圍內(nèi)。每種營養(yǎng)成分分別設(shè)置3個添加水平(見表3),每個水平平行測試6次,考察日內(nèi)、日間精密度。實驗結(jié)果顯示,10種營養(yǎng)成分的平均加標(biāo)回收率為82.8%～115.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.58%～11.49%,回收率和精密度良好(見表3)。

2.5 實際樣品測定

應(yīng)用本方法測定生姜樣品56份。樣品于2018年11月采自山東省各市縣的生姜種植基地。通過繪制箱形圖對該批生姜樣品中各營養(yǎng)成分的含量進行分析,結(jié)果顯示,56份生姜樣品中10種營養(yǎng)成分均有檢出,并且它們的含量水平存在較大差別。生姜樣品中10種營養(yǎng)成分含量水平的離散分布結(jié)果見圖3。

該批生姜樣品中,6-姜酚的含量范圍為182.63～1 028.33 mg/kg,圖中四分位距表示6-姜酚含量的集中分布,范圍為373.35～702.48 mg/kg?？傮w上看,10種營養(yǎng)成分含量呈現(xiàn)出5個水平,分別是:6-姜酚為100～1 200 mg/kg;10-姜酚、8-姜酚為10～300 mg/kg;6-姜烯酚、四氫姜黃素為0.2～10 mg/kg;10-姜烯酚、8-姜烯酚、姜黃素、去甲氧基姜黃素為0.02～2.0 mg/kg;雙去甲氧基姜黃素為<0.02 mg/kg。本實驗結(jié)果說明生姜中姜辣素類營養(yǎng)成分的含量比姜黃素類的高。6種姜辣素中,姜酚(6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚)含量高于姜烯酚含量(6-姜烯酚、10-姜烯8-姜烯酚); 6-姜酚含量高于10-姜酚和8-姜酚;6-姜烯酚含量高于10-姜烯酚和8-姜烯酚。4種姜黃素中,四氫姜黃素的含量高于姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素,雙去甲氧基姜黃素含量相對最低。

表 3 生姜樣品中10種營養(yǎng)成分在3個加標(biāo)水平下的平均回收率和RSD(n=6)

圖 3 生姜樣品中10種營養(yǎng)成分含量水平的離散分布Fig. 3 Discrete distribution of the contents of the 10 nutrients in ginger samples

3 結(jié)論

本文建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定生姜中10種營養(yǎng)成分的分析方法。該法分析時間快,能夠?qū)崿F(xiàn)對目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性和定量,適用于生姜中姜辣素類和姜黃素類營養(yǎng)成分的同步分析,可為生姜的品質(zhì)鑒定與質(zhì)量控制提供技術(shù)手段。