魏敏芝, 萬(wàn)建春, 張富生, 潘 華*

(1. 江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心, 江西 南昌 330012; 2. 江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院, 江西 南昌 330001)

喹乙醇是廣譜抗菌藥物,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌都有抑制作用,尤其對(duì)豬痢疾療效顯著。我國(guó)農(nóng)業(yè)部168號(hào)公告規(guī)定,不超過(guò)35 kg仔豬可以使用喹乙醇藥物,用于促進(jìn)其生長(zhǎng)。動(dòng)物喂食給藥的喹乙醇大部分以原形藥經(jīng)尿液排泄到體外,此外其代謝產(chǎn)物還包括1-或4-單氮氧化物和3-甲基喹喔啉-2-羧酸(MQCA),其中MQCA被國(guó)際食品法典委員會(huì)認(rèn)定為喹乙醇?xì)埩魳?biāo)志物。我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告235號(hào)規(guī)定豬肉中MQCA的限量值為4 μg/kg,歐盟和美國(guó)則禁止在動(dòng)物養(yǎng)殖中使用喹乙醇。2018年我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布2638號(hào)公告,要求停止生產(chǎn)喹乙醇原料藥及各種制劑;2019年5月1日起,喹乙醇被納入動(dòng)物養(yǎng)殖禁止使用的藥物范圍。

目前,動(dòng)物源食品中MQCA殘留量的前處理方式有酸解[1,2]和蛋白酶水解[3],其中酶解操作步驟繁瑣,檢測(cè)用時(shí)較長(zhǎng),而酸解處理的方式也更為便捷,且有文獻(xiàn)報(bào)道[1,4]可以通過(guò)提高酸解溫度縮短水解時(shí)間。動(dòng)物源食品中MQCA殘留量的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[5,6]、氣相色譜-質(zhì)譜法[7]、高效液相色譜法[1,8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-14]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高選擇性和高靈敏度的特點(diǎn),適合食品中禁用藥物殘留量的測(cè)定。MQCA的相對(duì)分子質(zhì)量較小,質(zhì)譜檢測(cè)易受干擾而影響定性判斷,而通過(guò)更多的特征碎片離子信息匹配度的比較,可以提高方法的抗干擾能力。本文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)豬肉中MQCA殘留量的方法,采用觸發(fā)式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式實(shí)現(xiàn)同時(shí)定量和確證,可為準(zhǔn)確監(jiān)控豬肉中MQCA的殘留狀況提供更可靠的檢測(cè)技術(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

1260-6470型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配ESI源)、VAC ELUT-20固相萃取裝置(美國(guó)Agilent公司); Vortex-Genie2渦旋混勻器(美國(guó)Scientific Industries公司); SHA-B恒溫水浴振蕩器(常州智博瑞儀器制造有限公司)。

MQCA(純度99.0%,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司);鹽酸、氯化鈉(上海國(guó)藥集團(tuán));氫氧化鈉(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠);氨水(質(zhì)譜純,上海安譜公司);乙酸乙酯、甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)Honeywell公司);甲酸(色譜純,美國(guó)Sigma公司)。強(qiáng)陰離子固相萃取小柱(MAX, 150 mg/6 mL,美國(guó)Waters公司);水為Milli-Q超純水。

確證測(cè)試樣品:豬肉樣品由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供(編號(hào)17-D707), MQCA殘留量為3.52 μg/kg。

1.2 樣品前處理

稱取勻漿后的豬肉試樣2.0 g,置于50 mL聚丙烯離心管中,加入10 mL 0.3 mol/L鹽酸溶液,于50 ℃水浴振蕩提取30 min,依次加入5 mL乙腈、15 mL乙酸乙酯、2.5 g氯化鈉,渦旋混合1 min,以8 000 r/min離心5 min,上層有機(jī)相全部轉(zhuǎn)移至另一50 mL聚丙烯離心管中;加入5 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液,渦旋混合30 s,以8 000 r/min離心5 min。吸取下層全部水相層轉(zhuǎn)入經(jīng)5 mL甲醇、5 mL水活化的MAX小柱內(nèi),再分別用5 mL水、5 mL甲醇、5 mL乙酸乙酯淋洗,用空氣吹干小柱內(nèi)液體。用8 mL甲酸-乙酸乙酯(2∶98, v/v)溶液洗脫,收集全部洗脫液,于45 ℃下氮?dú)獯蹈?用1 mL 0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈(5∶95, v/v)溶液溶解殘?jiān)?過(guò)0.22 μm尼龍濾膜,供LC-MS/MS測(cè)定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg MQCA標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解定容,配制1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-18 ℃下保存;用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,制得MQCA標(biāo)準(zhǔn)中間液,臨用現(xiàn)配。

基質(zhì)匹配添加標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:稱取6份陰性豬肉試樣,分別加入MQCA標(biāo)準(zhǔn)中間液,按1.2節(jié)處理,獲得質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 分析條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18柱(50 mm×3.0 mm, 1.8 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.1%(v/v)甲酸水溶液;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫條件:0～1.00 min, 5%A; 1.00～2.00 min, 5%A～40%A; 2.00～3.00 min, 40%A～90%A; 3.00～4.00 min, 90%A; 4.00～4.01 min, 90%A～5%A; 4.01～7.00 min, 5%A。進(jìn)樣體積:5 μL。

離子源:ESI源,正離子模式;掃描模式:動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(dynamic MRM);毛細(xì)管電壓:3 500 V;霧化氣壓力:310.2 kPa;鞘氣溫度:325 ℃;鞘氣流量:12 mL/min;噴嘴電壓:500 V;干燥氣溫度:200 ℃;干燥氣流量:11 mL/min;碎裂電壓:135 V。觸發(fā)掃描閾值:100 cps;觸發(fā)進(jìn)入時(shí)間:2 ms;觸發(fā)延遲時(shí)間:2 ms。MQCA的特征離子對(duì)和碰撞能量見(jiàn)表1。

表 1 MQCA的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion.

圖 1 不同碰撞能量下MQCA的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 1 MS/MS spectra of MQCA under different CEs

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

MQCA結(jié)構(gòu)中有喹啉雜環(huán),離子化時(shí)得到質(zhì)子,形成[M+H]+母離子。在15、20和25 eV碰撞能量下分別碎裂母離子,獲得不同碰撞能量下的二級(jí)子離子全掃描質(zhì)譜圖(見(jiàn)圖1)。碰撞能量為15 eV時(shí),得到m/z為145.1、143.2、117.8、91.9、76.9的碎片離子,此碰撞能量下仍可見(jiàn)m/z為189.0的母離子,但相對(duì)豐度很低。碰撞能量提高至20 eV時(shí),m/z為145.1和143.2的碎片離子強(qiáng)度有所下降,子離子全掃質(zhì)譜圖中增加了m/z為127.9、102.1、65.0的特征峰,母離子的響應(yīng)強(qiáng)度則與背景噪音水平相當(dāng)。碰撞能量提高至25 eV時(shí),沒(méi)有新碎片離子增加,所有碎片離子的響應(yīng)強(qiáng)度基本和碰撞能量20 eV下相當(dāng),由此確定MQCA的二級(jí)碎片離子的m/z為145.0、143.0、128.1、117.9、102.3、91.8、77.0和65.2。進(jìn)一步優(yōu)化各碎片離子的最佳碰撞能量,m/z為145.0和143.0兩個(gè)特征離子的響應(yīng)豐度最高,可作為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描離子,其中m/z為145.0的特征離子作為觸發(fā)掃描離子。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

MQCA具有酸堿兩性的特點(diǎn),其在酸性環(huán)境條件下,表現(xiàn)出疏水性,反相色譜柱適合其分離。Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(50 mm×3.0 mm, 1.8 μm)的固定相粒徑小,具有良好的保留性能,同時(shí)能縮短分析時(shí)間,適合酸性、堿性和中性化合物的分離。本文通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫條件,獲得了MQCA尖銳、對(duì)稱的色譜峰形和良好的色譜保留(見(jiàn)圖2)。本文用獲得的陰性豬肉基質(zhì)提取測(cè)試液,配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,對(duì)比了定容液配制的試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離效果(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明,MQCA能夠與基質(zhì)背景中的大部分極性和弱極性干擾物分離,可以降低干擾物共流出對(duì)MQCA電離的影響。

圖 2 MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液(5 μg/L)觸發(fā)式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig. 2 Trigger MRM chromatograms of MQCA standard solution (5 μg/L)

圖 3 陰性豬肉樣品、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(5 μg/L)的總離子流色譜圖Fig. 3 TIC chromatograms of blank pork sample,matrix standard solution and reagent standard solution (5 μg/L)

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

動(dòng)物組織樣品中MQCA殘留量的檢測(cè)多采用酶解[3,4]或酸水解[1,15]的前處理方式。酶解成本高,用時(shí)長(zhǎng),操作也繁雜;采用酸水解的方式,可以通過(guò)提高水解的溫度,進(jìn)而縮短水解時(shí)間。本文比較了2.0 mol/L和0.3 mol/L鹽酸的水解效果,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用0.3 mol/L鹽酸水解提取后,提取液仍是酸性環(huán)境,這適合有機(jī)溶劑直接萃取目標(biāo)物,而且提取效果也與采用2.0 mol/L鹽酸時(shí)一致,因此確定水解提取的鹽酸濃度為0.3 mol/L。

實(shí)驗(yàn)比較了不同萃取試劑的萃取效果,分別采用正己烷、乙酸乙酯、乙腈-乙酸乙酯(1∶3, v/v)3種溶劑。采用正己烷萃取,萃取效率最低,且樣液乳化嚴(yán)重,高速離心后仍有一定乳化現(xiàn)象;采用乙酸乙酯萃取,乳化情況稍好;采用乙腈和乙酸乙酯混合體系萃取時(shí),萃取效率最高,且試樣液中加入乙腈,可以沉淀試樣液中的蛋白質(zhì),再加入乙酸萃取,能明顯改善樣液的乳化現(xiàn)象。

MQCA在堿性條件可用陰離子交換固相萃取柱凈化[16]。萃取液中加入氫氧化鈉溶液,MQCA呈陰離子態(tài),可被MAX小柱吸附。實(shí)驗(yàn)依次用水、甲醇、乙酸乙酯淋洗小柱,以除去極性和非極性雜質(zhì),最后用酸化乙酸乙酯洗脫目標(biāo)物。本文對(duì)洗脫溶液體積進(jìn)行了優(yōu)化,將含5.0、10.0和50.0 μg/kg 3個(gè)水平的上樣液分別加入小柱,經(jīng)淋洗后,用酸化乙酯乙酯分多次洗脫小柱,每次用2 mL洗脫液,分別測(cè)試每次洗脫液中MQCA的含量,發(fā)現(xiàn)第4次洗脫小柱后,只有50.0 μg/kg水平試驗(yàn)的洗脫液中有少量目標(biāo)物檢出。當(dāng)洗脫液增加到10 mL時(shí),3個(gè)水平下的收集液中均未檢出目標(biāo)物。因此最終本文確定洗脫體積為8 mL。

2.4 定量測(cè)定

用陰性豬肉樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn),以目標(biāo)物信噪比(S/N)的3倍和10倍水平分別確定檢出限和定量限,分別為0.15 μg/kg和0.5 μg/kg。

用陰性豬肉樣品按前述方法制備獲得的空白基質(zhì)溶液,對(duì)比相同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液與試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值,發(fā)現(xiàn)樣品凈化后有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),因此本文確定用基質(zhì)匹配添加標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。在1.0～50 μg/L范圍內(nèi),MQCA呈線性相關(guān),相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 7。在0.5、1.0、5.0 μg/kg3個(gè)水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),MQCA的回收率為90.5%～119.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.14%～4.22%(見(jiàn)表2)。

表 2 豬肉中MQCA的加標(biāo)回收率(n=6)

圖 4 MQCA確證測(cè)試樣品質(zhì)譜圖與參考標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖對(duì)比Fig. 4 Comparison of mass spectra of the MQCA confirmed test sample with reference standard sample

2.5 確證實(shí)驗(yàn)

定性離子豐度比或特征離子匹配度是質(zhì)譜確證的主要方式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的選擇性很高,但仍存在基質(zhì)干擾導(dǎo)致假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn),尤其是小分子化合物的檢測(cè)。為提高確證結(jié)果的可靠性,選擇數(shù)量更多特征碎片離子的定性判斷會(huì)更可靠,但若連續(xù)監(jiān)測(cè)全部離子對(duì),會(huì)降低質(zhì)譜循環(huán)掃描時(shí)間,影響定量結(jié)果數(shù)據(jù)點(diǎn)的獲取。觸發(fā)式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)不僅能滿足定量分析的要求,而且可以通過(guò)觸發(fā)的二次掃描,獲得化合物確證的質(zhì)譜譜庫(kù)[17],通過(guò)比對(duì)樣品譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖,實(shí)現(xiàn)確證樣品中的待測(cè)物。實(shí)驗(yàn)采用中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供的豬肉樣品進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn),測(cè)得樣品中MQCA含量為3.46 μg/kg,同時(shí)也獲得觸發(fā)式MRM的質(zhì)譜圖。將該圖與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖比對(duì)(見(jiàn)圖4),表明測(cè)試樣品所獲特征離子與標(biāo)準(zhǔn)譜圖全部匹配。通過(guò)陽(yáng)性樣品的驗(yàn)證測(cè)試,表明本方法可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量和確證。

3 結(jié)論

本文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中MQCA殘留量的方法,方法采用觸發(fā)式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,準(zhǔn)確定量的同時(shí)也能獲取更多的質(zhì)譜信息,對(duì)于基體復(fù)雜的樣品能實(shí)現(xiàn)可靠的定性確證。方法采用基質(zhì)匹配添加標(biāo)準(zhǔn)曲線定量,方法回收率高,檢出限低,適合豬肉中MQCA殘留量的快速測(cè)定和確證。