王芳煥, 任翠娟, 馬 輝, 李 萍, 郝俊虎, 陳 林, 孫 敏

(銀川海關(guān)技術(shù)中心, 寧夏 銀川 750002)

枸杞是寧夏傳統(tǒng)出口農(nóng)產(chǎn)品,具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,不僅含有豐富的微量元素,而且含有大量糖、脂肪、蛋白質(zhì)、色素和維生素等物質(zhì)[1-3],也正是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)豐富,易受到病蟲害威脅,而有效防治病蟲害,必須使用化學(xué)農(nóng)藥。但是枸杞生產(chǎn)過(guò)程中,農(nóng)藥使用不合理,易造成枸杞產(chǎn)品農(nóng)藥殘留問(wèn)題。近幾年,出口日本和美國(guó)的枸杞干果,其監(jiān)控的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)分別為0.5和0.01 mg/kg,銷往香港和臺(tái)灣的枸杞干果,其監(jiān)控的擬除蟲菊酯類、有機(jī)磷類、殺螨劑、殺蟲劑等農(nóng)藥殘留項(xiàng)目均不得檢出。然而出口枸杞中檢出農(nóng)殘被官方通報(bào)的情況時(shí)有發(fā)生,包括啶蟲脒、毒死蜱、三唑酮等25種農(nóng)殘項(xiàng)目。隨著枸杞貿(mào)易地區(qū)對(duì)農(nóng)藥殘留監(jiān)控日益嚴(yán)苛,農(nóng)藥殘留已成為當(dāng)前影響我國(guó)枸杞質(zhì)量安全、出口創(chuàng)匯的主要因素。為了考察枸杞中農(nóng)藥的殘留情況,本實(shí)驗(yàn)室收集了代表性的枸杞樣品,采用GC-MS/MS方法,對(duì)400種農(nóng)藥殘留進(jìn)行了初步篩查,然后結(jié)合我國(guó)枸杞主要貿(mào)易國(guó)家或地區(qū)監(jiān)控的農(nóng)藥殘留項(xiàng)目,選取了有機(jī)磷、擬除蟲菊酯、殺螨劑、殺蟲劑等20種農(nóng)藥,進(jìn)行方法研究并建立定量方法。

目前農(nóng)藥多殘留快速檢測(cè)是理化分析研究熱點(diǎn),主要分為樣品前處理技術(shù)改進(jìn)和儀器檢測(cè)條件優(yōu)化。2003年,Anastassiades等[4]在基質(zhì)固相分散的基礎(chǔ)上開發(fā)了QuEChERS方法,其具有靈敏、高效、快速等特點(diǎn),近年來(lái)被廣泛應(yīng)用。經(jīng)典的QuEChERS方法雖簡(jiǎn)便快捷,但采用吸附劑種類少,無(wú)法去除色素、糖類、脂肪等對(duì)質(zhì)譜干擾較大的雜質(zhì)。本文分別考察了乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18和石墨化炭黑(GCB)3種吸附劑對(duì)枸杞樣品中雜質(zhì)的去除效果,最終優(yōu)化出最佳的吸附劑量。

目前多農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有分光光度計(jì)法[5]、酶聯(lián)免疫測(cè)定法[6]、生物傳感器測(cè)定法[7]、氣相色譜法(GC)[8]、液相色譜法[9]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[10-13]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[14-18]。在實(shí)際應(yīng)用中,GC易受基質(zhì)干擾,確證不足;GC-MS在檢測(cè)分子量低或者沸點(diǎn)較高的農(nóng)藥時(shí),易受基質(zhì)成分和柱流失干擾,影響檢測(cè)結(jié)果。本文采用GC-MS/MS檢測(cè)枸杞中20種農(nóng)藥殘留,不僅消除了枸杞中復(fù)雜基質(zhì)的干擾,而且實(shí)現(xiàn)了20種農(nóng)藥的快速、準(zhǔn)確定量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent7000A氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司), TDL-80-2B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠), QT-2A迷你漩渦振蕩器(上海琪特分析儀器有限公司), BD-202電子天平(梅特勒(上海)有限公司), CPA225D電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)。甲胺磷(methamidophos, CAS號(hào):10265-92-6)、甲拌磷(phorate, CAS號(hào):298-02-2)、甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl, CAS號(hào):5598-13-0)、馬拉硫磷(malathion, CAS號(hào):121-75-5)、毒死蜱(chlorpyrifos, CAS號(hào):2921-88-2)、對(duì)硫磷(parathion, CAS號(hào):56-38-2)、三唑酮(triadimefon, CAS號(hào):43121-43-3)、三唑醇(triadimenol, CAS號(hào):55219-65-3)、氟蟲腈(fipronil, CAS號(hào):120068-37-3)、氟硅唑(Fflusilazole, CAS號(hào):85509-19-9)、丙環(huán)唑(propiconazole, CAS號(hào):60207-90-1)、炔螨特(propargite, CAS號(hào):2312-35-8)、甲氰菊酯(fenpropathrin, CAS號(hào):39515-41-8)、雙甲脒(amitraz, CAS號(hào):33089-61-1)、氯氟氰菊酯(cyhalothrin, CAS號(hào):68085-85-8)、噠螨靈(pyridaben, CAS號(hào):96489-71-3)、氰戊菊酯(fenvalerate, CAS號(hào):51630-58-1)、順式氰戊菊酯(es-fenvalerate, CAS號(hào):66230-04-4)、苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole, CAS號(hào):119446-68-3)、氯氰菊酯(cypermethrin, CAS號(hào):52315-07-8)20種標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)量濃度均為100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所);乙腈、丙酮、正己烷均為色譜純(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司);吸附劑C18、GCB、PSA(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

1.2 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜柱為DB-5MS UI石英毛細(xì)管色譜柱,30 m×0.25 mm(內(nèi)徑)×0.25 μm(膜厚)。色譜柱升溫程序:40 ℃下保持1 min,以30 ℃/min的速率升至130 ℃,以5 ℃/min的速率升至250 ℃,以10 ℃/min的速率升至300 ℃,保持15 min。進(jìn)樣體積為1 μL;進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。

離子源為電子轟擊(EI)源;數(shù)據(jù)采集模式為MRM模式。進(jìn)樣口溫度為290 ℃,離子源溫度為230 ℃,四極桿(Q1和Q3)溫度為150 ℃,輔助溫度為280 ℃。載氣為純度≥99.999%的氦氣,流速為1.0 mL/min;碰撞氣為氮?dú)?電離能量為70 eV。定量、定性離子對(duì)和碰撞能量參數(shù)具體見表1。

1.3 樣品的前處理

稱取3.00 g已粉碎試樣于50 mL的聚四氟乙烯離心管中,加10 mL乙腈,均質(zhì)提取1 min,加4 g無(wú)水硫酸鎂和1 g氯化鈉,漩渦振蕩1 min,以4 500 r/min的速度離心5 min,取上清液待用。另取一支15 mL聚四氟乙烯離心管,加入1 200 mg無(wú)水硫酸鎂、45 mg GCB、400 mg C18和400 mg PSA粉吸附劑,加入6 mL上述上清液,渦旋混合1 min,以4 500 r/min的速度離心5 min,移取2 mL于15 mL試管中,氮吹濃縮近干,用丙酮-正己烷(3∶7, v/v)混合溶液定容至2 mL,待上機(jī)測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

參考GB 23200.8-2016中檢測(cè)條件,優(yōu)化質(zhì)譜條件。首先將20種農(nóng)藥分別配制成1 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照全掃描方式采集某種農(nóng)藥單標(biāo)準(zhǔn)溶液,選擇豐度高、質(zhì)荷比大且選擇對(duì)稱性好的離子作為母離子,然后在3～45 eV的范圍內(nèi),每3 eV為間隔,按照產(chǎn)物離子掃描方式優(yōu)化碰撞電壓,選擇強(qiáng)度和信噪比兼顧的離子分別作為定量和輔助定性子離子,最終得到優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù):母離子、子離子、碰撞電壓(見表1)。

表 1 20種農(nóng)藥的定量、定性離子對(duì)和碰撞能量

* Quantitative ion.

按表1中條件對(duì)20種農(nóng)藥的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行MRM采集,得到其總離子流圖,見圖1。

圖 1 質(zhì)量濃度均為100 μg/L的20種農(nóng)藥的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在MRM模式下的總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatogram for a mixed matrix- matched standard solution of the 20 pesticides (100 μg/L for each) in MRM mode Peak Nos.: 1. methamidophos; 2. phorate; 3. chlorpyrifos-methyl; 4. malathion; 5. chlorpyrifos; 6. parathion; 7. triadimefon; 8. fipronil; 9. triadimenol; 10. flusilazole; 11. propiconazole; 12. propargite; 13. fenpropathrin; 14. cyhalothrin; 15. amitraz; 16. pyridaben; 17. cypermethrin; 18. fenvalerate; 19. es-fenvalerate; 20. difenoconazole.

2.2 提取溶劑的選擇

在農(nóng)藥殘留分析中,一般用甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷等作為提取溶劑,而二氯甲烷或二氯甲烷-石油醚毒性很大,對(duì)實(shí)驗(yàn)人員構(gòu)成健康威脅。本試驗(yàn)考察了丙酮、正己烷、乙腈3種溶劑對(duì)樣品的提取效果。設(shè)定添加水平為2倍定量限(LOQ),其余步驟按照1.3節(jié)進(jìn)行試驗(yàn),平行檢測(cè)3次,結(jié)果表明,丙酮提取出的雜質(zhì)和色素較多;正己烷很難將極性大的農(nóng)藥提取出來(lái),而極性小的油脂易被共萃出來(lái);而乙腈提取效果最好,對(duì)農(nóng)藥的溶解性較強(qiáng),對(duì)油脂和色素等雜質(zhì)溶解度較小,提取效率最佳。

2.3 提取溶劑使用量及提取時(shí)間優(yōu)化

提取溶劑使用量及提取時(shí)間的選擇直接關(guān)系到測(cè)定結(jié)果的回收率。本文以乙腈作為提取溶劑,考察了二者對(duì)回收率的影響(見圖2)。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)2 min時(shí),回收率基本變化不大;提取溶劑用量為14 mL時(shí),回收率最高,但用量為10 mL時(shí),提取效率也可以滿足試驗(yàn)要求。綜合考慮了提取效率、基質(zhì)效應(yīng)、經(jīng)濟(jì)效益等方面,最終確定乙腈的用量為10 mL,提取時(shí)間為2 min。

圖 2 (a)提取時(shí)間和(b)乙腈用量對(duì)20種農(nóng)藥回收率的影響Fig. 2 Effects of (a) extraction time and (b) addition amount of acetonitrile on the recoveries of the 20 pesticides

2.4 吸附劑種類的選擇

在進(jìn)一步凈化的過(guò)程中,選擇C18、GCB和PSA作為分散固相萃取吸附劑,比較了不同吸附劑對(duì)目標(biāo)物凈化回收效果的影響。C18是一種非極性的廣譜性凈化吸附劑,以C18為分散固相萃取吸附劑時(shí),雖然樣品提取溶液顏色較深,但其能夠有效去除提取物中微量的非極性雜質(zhì)。GCB吸附劑表面具有正六元環(huán)結(jié)構(gòu),使其對(duì)平面分子有極強(qiáng)的親和力,能夠分離或去除枸杞中的色素以及固醇類雜質(zhì),有效去除樣品提取液的顏色。PSA吸附劑結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)氨基,通過(guò)離子交換作用或者氫鍵的形成,能有效去除樣品中的有機(jī)脂肪酸和糖等干擾物[19],這種混合型分散固相萃取吸附劑可以明顯改善凈化效果,因此,本試驗(yàn)選擇PSA、GCB和C18混合物作為分散固相萃取吸附劑進(jìn)行考察。當(dāng)PSA使用量為400 mg時(shí),凈化效果良好,定性定量更加準(zhǔn)確;低于400 mg時(shí),凈化不完全,干擾較為嚴(yán)重;大于400 mg時(shí),其吸附農(nóng)藥的量會(huì)隨之增加,影響農(nóng)藥的測(cè)定。當(dāng)C18加入量為400 mg時(shí),20種農(nóng)藥的回收率較高;當(dāng)加入量低于或高于400 mg時(shí),回收率較低。加入GCB的量在45 mg為宜,脫色效果最佳。綜合考慮,本試驗(yàn)采用45 mg GCB, 400 mg C18和400 mg PSA粉作為吸附劑。

2.5 靈敏度考察

由于枸杞樣品中含有較多的糖類、油脂、色素等復(fù)雜雜質(zhì),可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響,鑒于此,分別采用SIM和MRM模式進(jìn)行考察。以馬拉硫磷、毒死蜱、對(duì)硫磷作為目標(biāo)物,制備枸杞基質(zhì)加標(biāo)樣品,分別進(jìn)行SIM和MRM兩種模式掃描,結(jié)果見圖3。

SIM模式針對(duì)一級(jí)質(zhì)譜而言,即只掃描一個(gè)特征離子,目標(biāo)離子響應(yīng)高,但基質(zhì)噪音也大。而MRM模式針對(duì)二級(jí)質(zhì)譜而言,Q1和Q3分別采集一個(gè)特征離子,進(jìn)一步降低噪音和基質(zhì)干擾,信噪比會(huì)更高,定性更準(zhǔn)確,尤其對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)、背景高的樣品。通過(guò)圖3的比較可知,SIM模式下的色譜圖背景噪音高,信號(hào)干擾大;MRM模式采集譜圖的背景噪音明顯降低,S/N升高。因此MRM模式較SIM模式靈敏度更高,定性更準(zhǔn)確。

圖 3 枸杞基質(zhì)加標(biāo)溶液(馬拉硫磷、毒死蜱和對(duì)硫磷)在SIM和MRM模式下的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of wolfberry matrix spiked with standard solutions of malathion, chlorpyrifos, and parathion in SIM mode and MRM mode

2.6 基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)效應(yīng)是指色譜分離時(shí)共洗脫的物質(zhì)改變了待測(cè)成分的離子化效應(yīng),所引起的信號(hào)的抑制或提高?；|(zhì)效應(yīng)影響大時(shí)會(huì)降低方法的靈敏度和準(zhǔn)確性,給測(cè)定帶來(lái)誤差,本文通過(guò)配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和基質(zhì)匹配校正曲線,以峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖,以基質(zhì)匹配校正曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來(lái)考察化合物的基質(zhì)效應(yīng)。一般認(rèn)為,基質(zhì)匹配校正曲線斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值在85%～115%之間不存在基質(zhì)效應(yīng)[20-23]。圖4表明,對(duì)于甲胺磷、甲拌磷、甲基毒死蜱、毒死蜱、三唑酮、三唑醇峰2、氟硅唑、丙環(huán)唑、炔螨特、甲氰菊酯、雙甲脒、噠螨靈、氯氰菊酯,其基質(zhì)匹配校正曲線斜率為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的74.1%～111.8%,不存在基質(zhì)效應(yīng);而對(duì)于馬拉硫磷、對(duì)硫磷、三唑醇峰1、氟蟲腈、氯氟氰菊酯峰、氰戊菊酯和苯醚甲環(huán)唑峰,基質(zhì)匹配校正曲線斜率分別為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的118.6%～135.2%,存在明顯的基質(zhì)增強(qiáng)作用。綜合考慮,本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)方法進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。

圖 4 20種農(nóng)藥在枸杞樣品中的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 4 Matrix effects for the 20 pesticides in wolfberry

表 2 20種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

由于基質(zhì)效應(yīng)的存在,使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定量分析。配制質(zhì)量濃度水平分別為5、10、25、50、100和500 μg/L的20種農(nóng)藥溶液,建立20種農(nóng)藥在枸杞基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有農(nóng)藥的線性良好,線性相關(guān)系數(shù)(R2)均不小于0.99,各農(nóng)藥的線性相關(guān)系數(shù)在0.990～0.999之間。

稱取20份枸杞,分別在其中添加某一預(yù)期濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品,按照1.3節(jié)步驟進(jìn)行前處理,然后上機(jī)測(cè)試,保證每次均有響應(yīng)信號(hào),且S/N在3附近,那么該濃度即為此種農(nóng)藥的方法檢出限。

線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。檢出限為0.017～0.050 mg/kg,以檢出限的3倍確定定量限。方法線性范圍可以滿足枸杞樣品檢測(cè)的需要。

2.8 方法精密度和回收率

設(shè)定添加水平為1、2、10倍LOQ,分別稱取6份枸杞試樣,按照1.3節(jié)步驟進(jìn)行試驗(yàn),其回收率在71.5%～109.7%之間,測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.94%～9.87%之間,詳見表3。

2.9 方法應(yīng)用

本方法具有快速、簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高和精密度好的優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)用于枸杞樣品中多種農(nóng)藥殘留的篩查。選取20個(gè)枸杞樣本,應(yīng)用本方法進(jìn)行了分析測(cè)試,檢測(cè)結(jié)果顯示本地區(qū)枸杞中氯氟氰菊酯、噠螨靈、苯醚甲環(huán)唑和氯氰菊酯檢出率分別為30%、25%、35%、30%,其中氯氟氰菊酯檢出值達(dá)1.759 mg/kg,以上4種農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)較高。在今后枸杞種植過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制農(nóng)藥種類及劑量使用,加強(qiáng)枸杞產(chǎn)品質(zhì)量安全建設(shè),以滿足出口國(guó)家或地區(qū)殘留限量的要求,從而保護(hù)消費(fèi)者的身體健康。

表 3 20種農(nóng)藥在枸杞中3個(gè)添加水平下的加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定枸杞中多種農(nóng)藥殘留,前處理方法省時(shí)省力,操作簡(jiǎn)便,不易交叉污染,MRM模式減少了基質(zhì)對(duì)農(nóng)藥的定量、定性離子干擾,同時(shí)也提高了方法的靈敏度。該方法分離效果好、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好,在實(shí)際工作中取得了令人滿意的結(jié)果。