周曉晴, 呂小麗, 萬(wàn)建春, 郭 平*, 郭 丹, 席慧婷

(1. 江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院, 江西 南昌 330001;2. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江西 南昌 330047)

氯酸鹽和高氯酸鹽是一類生活中普遍存在的有害污染物。氯酸鹽是二氧化氯消毒產(chǎn)生的無(wú)機(jī)副產(chǎn)物,也可由自然界中含氯化合物分解產(chǎn)生。氯酸鹽具有強(qiáng)氧化性,會(huì)影響人體的血液系統(tǒng),引起高鐵性血紅蛋白血癥[1]和貧血癥,也可能導(dǎo)致神經(jīng)和呼吸道中毒,降低精子活力和數(shù)量[2-4]。高氯酸鹽常用作化肥原料,大氣中也能夠產(chǎn)生高氯酸根[5]。人工合成的高氯酸鹽作為氧化劑被廣泛用于煙花生產(chǎn)、橡膠制造、皮革加工、火箭固體推進(jìn)劑等化工領(lǐng)域[6],生產(chǎn)中不合理的處理易導(dǎo)致其遷移至地表水中,污染土壤、飲用水和食品。毒理學(xué)研究[7,8]表明,高氯酸鹽對(duì)人體健康的影響主要集中在甲狀腺功能方面,它可抑制碘的吸收,引起甲狀腺功能失調(diào),影響人體正常生長(zhǎng)發(fā)育。考慮健康風(fēng)險(xiǎn),歐洲食品安全局(EFSA)設(shè)定氯酸鹽和高氯酸鹽的每日可耐受攝入量分別為3和0.3 μg/kg BW/day[9]。在奶粉生產(chǎn)過(guò)程中,氯酸鹽和高氯酸鹽可能作為中間生產(chǎn)的污染物,殘留在奶粉中,而我國(guó)目前暫未制定氯酸鹽和高氯酸鹽的限量標(biāo)準(zhǔn),因此對(duì)奶粉中的殘留量進(jìn)行監(jiān)控十分必要。

近年來(lái),應(yīng)用于檢測(cè)氯酸鹽和高氯酸鹽的方法有分光光度法[10]、離子色譜法[11,12]、離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[13-15]、高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法等[16-18]。分光光度法的檢測(cè)設(shè)備條件要求不高,早期用于高氯酸鹽含量的粗篩,由于設(shè)備靈敏度的問(wèn)題,只適用于較高含量的測(cè)定。離子色譜雖能對(duì)飲用水、水果和蔬菜等各種食品進(jìn)行較為準(zhǔn)確地定量,但電導(dǎo)檢測(cè)器缺乏選擇性,離子色譜法存在干擾嚴(yán)重、檢測(cè)易假陽(yáng)性和不能進(jìn)行痕量定量的缺點(diǎn)。離子色譜-質(zhì)譜雖較離子色譜有很大優(yōu)勢(shì),但I(xiàn)C-MS/MS在實(shí)際應(yīng)用中存在普及率低、離子色譜柱不耐受有機(jī)溶劑、大體積進(jìn)樣易造成柱子過(guò)載等問(wèn)題。隨著液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,這種技術(shù)靈敏度高、定性準(zhǔn)確,正越來(lái)越廣泛地應(yīng)用在了高氯酸鹽的檢測(cè)分析中。但應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少。

奶粉基質(zhì)復(fù)雜,為提高氯酸鹽和高氯酸鹽檢測(cè)的準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)在已有研究基礎(chǔ)上,利用LC-MS/MS結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法定量檢測(cè)手段,建立了奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的測(cè)定方法。與現(xiàn)有的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-18]相比,通過(guò)優(yōu)化樣品提取劑和固相萃取凈化過(guò)程,選擇0.1%(v/v)甲酸-乙腈對(duì)樣品進(jìn)行提取,提取液經(jīng)PRiME HLB固相萃取柱凈化后直接上機(jī)分析,無(wú)需濃縮,操作簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確度高,改善了譜峰寬的不足。本方法可適用于奶粉等乳制品中氯酸鹽和高氯酸鹽的快速檢測(cè)和監(jiān)控。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY UPLC TQS高效液相色譜-質(zhì)譜儀(配備電噴霧離子(ESI)源)(美國(guó)Waters公司); G-16離心機(jī)(德國(guó)Sartorius公司); Vortex Wizard渦旋儀(意大利VELP公司); VAC ELUT-20固相萃取裝置(美國(guó)Agilent公司); Synergy純水系統(tǒng)(德國(guó)Merck Millipore公司)。Thermo Scientific Acclaim TRINITY P1復(fù)合離子交換柱(50 mm×2.1 mm, 3 μm)(美國(guó)賽默飛公司)。MCE混合纖維素酯膜(0.22 μm,島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司); PES聚醚砜膜(0.22 μm,津騰);尼龍膜(0.22 μm,島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司)。PRiME HLB、C18和PSA(N-丙基乙二胺)固相萃取柱(美國(guó)Waters公司);石墨化炭黑Carb和OnGuard Ⅱ RP固相萃取柱(博納艾杰爾科技有限公司)。氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 000 mg/L,農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所),18O3氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)(200 mg/L,美國(guó)EURL-SRM公司),高氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液、18O4高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)(均為100 mg/L,美國(guó)CIL公司);甲醇、乙腈均為色譜純(西班牙Scharlau公司),甲酸、乙酸銨為色譜純(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);實(shí)驗(yàn)用奶粉樣品均購(gòu)自超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)中間溶液:準(zhǔn)確吸取0.1 mL氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 000 mg/L)于10 mL容量瓶中,用超純水稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,置于4 ℃冰箱保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液:分別準(zhǔn)確吸取2 mL氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(10 mg/L)、0.1 mL高氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液(100 mg/L),置于同一10 mL容量瓶中,用超純水稀釋至刻度,搖勻,制成氯酸鹽、高氯酸鹽質(zhì)量濃度分別為2.0、1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,置于4 ℃冰箱保存。

混合同位素內(nèi)標(biāo)液:分別準(zhǔn)確吸取0.05 mL氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)(200 mg/L)、0.1 mL高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)(100 mg/L),置于同一10.0 mL容量瓶中,用超純水稀釋至刻度,搖勻,制成氯酸鹽-18O3、高氯酸鹽-18O4質(zhì)量濃度分別為4.0、1.0 mg/L的混合同位素內(nèi)標(biāo)液,置于4 ℃冰箱保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制:分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液及混合同位素內(nèi)標(biāo)液適量,用20 mmol/L乙酸銨-甲醇溶液(1∶2, v/v)稀釋,制成系列質(zhì)量濃度的氯酸鹽溶液:2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 μg/L,和高氯酸鹽溶液:1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液中,氯酸鹽-18O3、高氯酸鹽-18O4的質(zhì)量濃度分別為20.0、5.0 μg/L。

1.3 樣品前處理

1.3.1樣品提取

準(zhǔn)確稱取試樣2 g(精確至0.001 g),置于50 mL具塞離心管中,加入75 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)液,再加入5 mL 0.1%(v/v)甲酸水溶液,迅速混勻,置于45 ℃水浴超聲20 min,渦旋振蕩5 min,再準(zhǔn)確加入10.0 mL乙腈,混勻,于10 000 r/min下常溫離心10 min,取上清液待凈化。

1.3.2樣品凈化

取3 mL上清液過(guò)PRiME HLB固相萃取柱,并接上0.22 μm MCE混合纖維素酯膜,收集續(xù)濾液,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Thermo Scientific Acclaim TRINITY P1復(fù)合離子交換柱(50 mm×2.1 mm, 3 μm)(美國(guó)賽默飛公司);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:A為乙腈,B為20 mmol/L乙酸銨溶液;流速:0.5 mL/min。梯度洗脫程序:0～0.5 min, 35%A; 0.5～4.0 min, 35%A～65%A; 4.0～5.0 min, 65%A～90%A; 5.0～7.0 min, 90%A; 7.0～8.0 min, 90%A～35%A; 8～10 min, 35%A。進(jìn)樣量:3 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI源,負(fù)離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;毛細(xì)管電壓:3 kV;錐孔電壓:60 V;脫溶劑溫度:600 ℃;脫溶劑氣流量:1 000 L/h;錐孔氣流量:150 L/h。4種化合物的其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

以氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)象,在負(fù)離子模式下,用全掃方式進(jìn)行掃描,確定目標(biāo)物的分子離子,考慮子離子豐度很弱,為滿足低分辨質(zhì)譜四分法原則,選取兩對(duì)母離子m/z82.9和m/z84.9,在一定碰撞氣和碰撞能條件下通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜碎裂,分別獲取了子離子m/z66.9和m/z68.9,選取m/z66.9為定量離子。按同樣的方法得到高氯酸鹽的母離子為m/z98.9和m/z100.9,子離子m/z83.0和m/z85.0,選取m/z83.0為定量離子。根據(jù)氯酸鹽和高氯酸鹽的響應(yīng)手動(dòng)調(diào)節(jié)確定錐孔電壓為60 V,優(yōu)化后的碰撞能量參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 氯酸鹽和高氯酸鹽的母離子、子離子、碰撞能量及內(nèi)標(biāo)物

* Quantitative ion.

2.2 色譜柱的選擇

氯酸鹽和高氯酸鹽均為具有極性的離子化合物,在反相色譜柱C18柱上難以保留,易出現(xiàn)峰形寬、拖尾或分叉的現(xiàn)象。SN/T 4089-2015[19]中使用IC-PakTMAnion HR的一款陰離子交換型色譜柱,高氯酸鹽峰形寬,時(shí)間跨度為1 min。Thermo Scientific Acclaim TRINITY P1柱屬于離子交換型色譜柱,其填料的鍵合相可提供陰陽(yáng)離子交換和反相的功能。本方法選取Thermo Scientific Acclaim TRINITY P1柱進(jìn)行測(cè)定?？紤]色譜柱洗脫需用鹽類,故選擇液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法中較常用且較易揮發(fā)的乙酸銨。Thermo Scientific Acclaim TRINITY P1柱兼具反相功能,洗脫需用有機(jī)溶劑,乙腈洗脫能力大于甲醇,綜合考慮選擇20 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈為流動(dòng)相,流速0.5 mL/min。在此條件下,氯酸鹽出峰時(shí)間為1.58min,高氯酸鹽出峰時(shí)間為3.84min。氯酸鹽和高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

圖 1 氯酸鹽、高氯酸鹽及其內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖Fig. 1 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatograms of chlorate, perchlorate and their internal standards

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1濾膜的選擇

在色譜分析中,為避免堵塞管路,通常選用濾膜對(duì)待測(cè)樣液進(jìn)行過(guò)濾。本文比較了MCE混合纖維素酯膜、PES聚醚砜膜和尼龍膜對(duì)氯酸鹽和高氯酸鹽測(cè)定的影響。用0.1%(v/v)甲酸水-乙腈(1∶2, v/v)配制10 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別過(guò)MCE混合纖維素酯膜、PES聚醚砜膜和尼龍膜后,與未過(guò)膜的10 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液一同上機(jī)檢測(cè),同時(shí)做濾膜空白試驗(yàn)。

3種濾膜的不加標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白試驗(yàn)均未檢出目標(biāo)組分。從表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,過(guò)膜對(duì)4種化合物的回收率有影響。其中尼龍膜的影響最大,使高氯酸鹽和高氯酸鹽內(nèi)標(biāo)的回收率下降近約90%,說(shuō)明濾膜會(huì)對(duì)目標(biāo)物有吸附,所以導(dǎo)致回收率下降。結(jié)果表明,尼龍膜的吸附作用最強(qiáng),PES聚醚砜膜次之,尼龍膜和PES聚醚砜膜的吸附情況與吳映璇等[20]的研究結(jié)果一致。因此最終確定采用MCE混合纖維素酯膜,然后上機(jī)檢測(cè)。

表 2 不同濾膜對(duì)氯酸鹽和高氯酸鹽的吸附情況

2.3.2凈化柱的選擇

固相萃取柱是凈化的主要方式,本文比較了PRiME HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱、石墨化炭黑Carb固相萃取柱、PSA固相萃取柱和OnGuard Ⅱ RP固相萃取柱對(duì)氯酸鹽和高氯酸鹽及其內(nèi)標(biāo)的凈化效果。

使用前,C18固相萃取柱分別用5 mL色譜純甲醇和5 mL超純水進(jìn)行活化,石墨化炭黑Carb固相萃取柱、PSA固相萃取柱和OnGuard Ⅱ RP固相萃取柱分別用5 mL色譜純甲醇進(jìn)行活化。分別在準(zhǔn)備好的5種固相萃取柱上上樣5 mL 10 μg/L的氯酸鹽和高氯酸鹽混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,收集全部流出液與未過(guò)柱的10 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液一同上機(jī)檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表 3 經(jīng)5種固相萃取柱凈化后4種化合物的回收率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PRiME HLB固相萃取柱和C18固相萃取柱的回收率相近,優(yōu)于OnGuard Ⅱ RP固相萃取柱和石墨化炭黑Carb固相萃取柱,PSA固相萃取柱的回收率最差。由于PRiME HLB固相萃取柱不用活化,具有操作時(shí)間短、節(jié)省試劑的優(yōu)點(diǎn),本方法最終選取PRiME HLB固相萃取柱為凈化柱。

2.3.3提取溶劑的選擇

稱取2 g奶粉樣品。氯酸鹽和高氯酸鹽的添加量分別為60和30 μg/kg。分別選用超純水-甲醇(1∶2, v/v)、超純水-乙腈(1∶2, v/v)、0.1%甲酸水溶液-甲醇(1∶2, v/v)、0.1%甲酸水溶液-乙腈(1∶2, v/v)、0.05%氨水溶液-甲醇(1∶2, v/v)、0.05%氨水溶液-乙腈(1∶2, v/v)進(jìn)行提取,采用PRiME HLB固相萃取柱凈化,計(jì)算氯酸鹽和高氯酸鹽的回收率(見(jiàn)圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用0.1%甲酸水溶液-乙腈的提取凈化效果最優(yōu),對(duì)氯酸鹽和高氯酸鹽的回收率穩(wěn)定(98.06%～100.69%和103.69%～105.86%)。0.1%甲酸水溶液-甲醇、超純水-乙腈、0.05%氨水溶液-乙腈、超純水-甲醇進(jìn)行提取時(shí),存在一定雜質(zhì)干擾,提取液會(huì)出現(xiàn)混濁現(xiàn)象,0.05%氨水溶液-甲醇的提取液無(wú)法過(guò)柱凈化。

奶粉中含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等有機(jī)成分。乙腈去除蛋白質(zhì)的能力優(yōu)于甲醇。相比其他試劑,乙腈-水體系提取出來(lái)的脂肪相對(duì)較少,而酸性條件有利于蛋白質(zhì)的沉淀。因此,本方法選擇用5 mL 0.1%甲酸水溶液提取20 min后,加10 mL乙腈測(cè)定蛋白質(zhì)。

圖 2 不同提取溶液對(duì)氯酸鹽和高氯酸鹽回收率的影響Fig. 2 Effect of the different extraction solutions on the recoveries of chlorate and perchlorateFA: formic acid.

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線比較法[7],對(duì)奶粉前處理方法的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。標(biāo)準(zhǔn)曲線A:用20 mmol/L乙酸銨-甲醇溶液(1∶2, v/v)稀釋,制成含氯酸鹽依次為2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 μg/L,高氯酸鹽依次為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)曲線B:用不含氯酸鹽和高氯酸鹽的奶粉樣品,按照1.3節(jié)樣品前處理方法進(jìn)行提取凈化,用凈化液配制同樣質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線。由基質(zhì)效應(yīng)(ME,%)=斜率B曲線/斜率A曲線×100%計(jì)算,得到氯酸鹽的ME為63%,高氯酸鹽的ME為83%。結(jié)果顯示,奶粉樣品的基質(zhì)效應(yīng)為基質(zhì)抑制,因此采用外標(biāo)法定量存在誤差。采用同位素內(nèi)標(biāo)法,同位素內(nèi)標(biāo)與待測(cè)目標(biāo)物的色譜和質(zhì)譜行為相近,可以補(bǔ)償氯酸鹽和高氯酸鹽因基質(zhì)效應(yīng)影響引起的響應(yīng)變化,以解決因基質(zhì)效應(yīng)造成定量不準(zhǔn)的問(wèn)題[3,9,21]。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線性范圍和定量限

將不同質(zhì)量濃度的氯酸鹽和高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液按本方法確定的條件進(jìn)行測(cè)定,以氯酸鹽和高氯酸鹽及其對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo),以質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,氯酸鹽和高氯酸鹽在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999(見(jiàn)表4)。以10倍信噪比(S/N)確定氯酸鹽的定量限,為15.0 μg/kg,高氯酸鹽的定量限為7.5 μg/kg。

表 4 氯酸鹽和高氯酸鹽的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

ND: not detected.

2.5.2回收率和精密度

選取氯酸鹽和高氯酸鹽污染水平較低的奶粉樣品,參照GB/T 27404-2008[22]在2倍、4倍、8倍方法定量限水平,做加標(biāo)回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)。其中氯酸鹽的添加水平為30.0、60.0、120.0 μg/kg,高氯酸鹽的添加水平為15.0、30.0、60.0 μg/kg,每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次,測(cè)得的回收率和精密度見(jiàn)表5。結(jié)果顯示,方法的回收率為89.24%～107.85%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.15%～10.42%,符合GB/T 27404-2008標(biāo)準(zhǔn)的要求。實(shí)驗(yàn)空白、樣品和加標(biāo)樣品的MRM色譜圖見(jiàn)圖3。

表 5 氯酸鹽和高氯酸鹽的回收率及精密度(n=6)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

用本文建立的方法對(duì)實(shí)際奶粉樣品進(jìn)行檢測(cè)。10批奶粉樣品的檢測(cè)結(jié)果如表6所示。氯酸鹽檢出5批,含量范圍在19.62～85.25 μg/kg之間。大多數(shù)樣品中,高氯酸鹽均有不同程度的檢出,其中6批樣品的高氯酸鹽含量超出方法定量限7.5 μg/kg,含量范圍為10.34～28.79 μg/kg。

圖 3 實(shí)驗(yàn)空白、樣品和加標(biāo)樣品的MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of the blank, a sample, and a spiked sampleSpiked levels: chlorate, 60.0 μg/kg; perchlorate, 30.0 μg/kg.

表 6 奶粉樣品中氯酸鹽和高氯酸鹽的測(cè)定結(jié)果

ND: not detected.

3 結(jié)論

本研究建立了奶粉樣品經(jīng)提取、固相萃取柱凈化,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析的檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)單、快速,重現(xiàn)性好,定量準(zhǔn)確,能滿足奶粉樣品中氯酸鹽和高氯酸鹽同時(shí)檢測(cè)的要求,能為我國(guó)奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽殘留情況的監(jiān)控提供技術(shù)支撐。