劉讓東, 許歆瑤, 王薇薇, 王 彥, 閆 超

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200240)

美國(guó)Likky公司在1982年首次將重組胰島素投放市場(chǎng),標(biāo)志著第一個(gè)重組蛋白質(zhì)藥物的誕生[1]。自其誕生以后,相對(duì)于傳統(tǒng)化學(xué)藥物而言,蛋白質(zhì)藥物研發(fā)成本相對(duì)較低、風(fēng)險(xiǎn)較小且更安全可靠;因此,蛋白質(zhì)藥物的研究成為現(xiàn)今藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)[2-7]。但是,蛋白質(zhì)藥物的結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜,微小的結(jié)構(gòu)改變常會(huì)對(duì)其生物活性和特異性表達(dá)有著明顯的影響。在蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)過程中,會(huì)因生產(chǎn)條件的變化而導(dǎo)致其異構(gòu)體、突變物、多聚體等的形成。然而,用普通的檢測(cè)儀器(如HPLC、MS等)難以辨別這些細(xì)微差別所引起的等電點(diǎn)(pI)的變化,不能很好地對(duì)蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行質(zhì)量控制。

毛細(xì)管等電聚焦(capillary isoelectric focusing, cIEF)兼具傳統(tǒng)凝膠IEF(isoelectric focusing)的高分辨率和毛細(xì)管電泳的自動(dòng)化、高效的優(yōu)勢(shì),可用于蛋白質(zhì)純化的檢測(cè)、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和電荷差異性測(cè)定等,在蛋白質(zhì)分析和蛋白質(zhì)組學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域都有很好的應(yīng)用。近年來(lái),一些公司及科研機(jī)構(gòu)陸續(xù)發(fā)表了cIEF方法用于單抗等生物兩性物質(zhì)的研究工作。2018年,百時(shí)美施貴寶公司的Dai等[8]報(bào)道了采用cIEF-MS技術(shù)對(duì)單抗藥物的電荷異質(zhì)性進(jìn)行分離和表征。同年,Wang等[9]實(shí)現(xiàn)了利用cIEF-MS技術(shù)對(duì)肽類、蛋白質(zhì)類以及單抗藥物的等電點(diǎn)和分子量的分析。Srivorakun等[10]基于cIEF系統(tǒng)來(lái)診斷東南亞人群中常見的血紅蛋白病;Meng等[11]通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)多肽的等電點(diǎn)的測(cè)定,驗(yàn)證了cIEF-WCID(whole column imaging detection)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。但是,這些自由溶液cIEF的方法需向樣品溶液中添加一定濃度的載體兩性電解質(zhì)(carrier ampholytes, CAs),以保證形成pH梯度,這會(huì)導(dǎo)致其檢測(cè)波長(zhǎng)可選性有限(一般選擇280 nm),且CAs還會(huì)帶來(lái)檢測(cè)穩(wěn)定性差、靈敏度低、不易與MS聯(lián)用等缺點(diǎn)。

然而,固化pH梯度毛細(xì)管等電聚焦不需在緩沖溶液和樣品中添加其他的能產(chǎn)生pH梯度的物質(zhì),具有方法穩(wěn)定、重復(fù)性好、檢測(cè)干擾小、靈敏度高的特點(diǎn)。同時(shí),在固化pH梯度柱的制備過程中,基質(zhì)材料的引入有可能拓寬原有CAs的pH范圍,從而達(dá)到對(duì)極端的酸性或堿性蛋白質(zhì)檢測(cè)的目的。目前,聚合物材料因其制備簡(jiǎn)單、操作方便而被廣泛地用作固化pH梯度毛細(xì)管等電聚焦柱的制備基質(zhì)[12-19]。本文根據(jù)課題組[20]先前制備固化pH梯度涂層毛細(xì)管開管柱的方法,制備了pH 3～10范圍的基于聚乙二醇雙丙烯酸酯-甲基丙烯酸縮水甘油酯材料(PEGDA-GMA)的固化pH梯度毛細(xì)管等電聚焦整體柱(M-IPG)。在柱上“單點(diǎn)”檢測(cè)時(shí),制備的M-IPG柱的pH范圍能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)所用CAs范圍的覆蓋。同時(shí),基于該M-IPG柱具有較大反壓的特點(diǎn),搭建了新型的等電聚焦平臺(tái)。為了檢驗(yàn)該M-IPG柱的效果,設(shè)計(jì)了平行對(duì)照實(shí)驗(yàn):以曲托珠單抗和依那西譜為分析對(duì)象,同時(shí)用羥丙基纖維素(HPC)涂層柱與M-IPG柱對(duì)該蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行等電點(diǎn)測(cè)定。另外,本文也將從實(shí)驗(yàn)的各個(gè)角度對(duì)上述兩種方法進(jìn)行對(duì)比,如等電聚焦柱的制備難易、pI的測(cè)定結(jié)果、峰寬、分離度、分析時(shí)間等。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CE1000毛細(xì)管電泳儀、qCE-3010/HVP高壓電源、TriSep-2100微流控制器(美國(guó)通微); KQ5200DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司); LC-20AD HPLC泵(日本島津); Longerpump LSP01-2A微流注射泵(河北保定蘭格恒流泵有限公司);漩渦VORTEX-GENIE2混合器(美國(guó)Scientific Industries); DZF-1B真空干燥箱(上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); JD200-3電子天平(鄭州南北儀器有限公司); Molcell 1805V摩爾細(xì)胞型純水儀(重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司)。

PEGDA(質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%,平均相對(duì)分子質(zhì)量為258)、GMA(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯(γ-MAPS,質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%)(美國(guó)ALDRICH),偶氮二異丁腈(AIBN, AR(analytical reagent))(上海第四試劑廠),甲醇(AR)、正癸醇(AR)、二氯甲烷(AR)、H3PO4(AR)、NaOH(AR)(中國(guó)醫(yī)藥基團(tuán)), Pharmalyte 3-10(reagent grade)(瑞典GE), HPC(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)(美國(guó)Sigma),細(xì)胞色素c(cytochrome c, reagent grade)、胰蛋白酶原(trypsinogen, reagent grade)、肌紅蛋白(myoglubin, reagent grade)(中國(guó)Sangon),碳酸酐酶(carbonic anhydrase, 1.5 U/mg)、牛血清白蛋白(BSA, biotech grade)(中國(guó)J&K),依那西譜(etanercept,質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%)(德國(guó)Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG),曲托珠單抗(trastuzumab,質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%)(瑞士Roche),聚亞酰胺涂層毛細(xì)管(75 μm i. d., 375 μm o. d.)(河北永年銳灃色譜器件有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品溶液的配置

5%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))HPC溶液:取0.05 g HPC于1.5 mL的EP管中,加入600 μL 60 ℃純凈水,室溫下攪拌至完全溶脹,形成膠體,然后再加入400 μL純凈水,混合均勻,即為5%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))的HPC溶液。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品:分別配置5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)儲(chǔ)備液;待用時(shí)分別移取適量上述蛋白質(zhì)儲(chǔ)備液于一個(gè)0.5 mL離心管中,依次移取純凈水、已經(jīng)制備好的5%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))HPC溶液和載體兩性電解質(zhì)(Pharmalyte 3-10)加入其中,振搖使其混合均勻,制得相應(yīng)樣品溶液。

稱取少許不同蛋白質(zhì)純品,將其溶入去離子水中,標(biāo)為貯備液,放入2～8 ℃的冰箱中。根據(jù)實(shí)際情況配置不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,具體各混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度見后文各色譜圖。

圖 1 固化pH梯度毛細(xì)管等電聚焦整體柱(M-IPG)的制備Fig. 1 Preparation of capillary isoelectric focusing with monolithic immobilized pH gradient (M-IPG)γ-MAPS: 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate; CAs: carrier ampholytes.

1.2.2M-IPG柱的制備

新買的毛細(xì)管分別經(jīng)過1.0 mmol/L氫氧化鈉處理30 min、去離子水處理10 min、0.1 mmol/L鹽酸處理30 min、去離子水處理10 min、純甲醇處理30 min, N2氣吹干,待用。M-IPG柱的制備如圖1所示,配置50%(體積分?jǐn)?shù))的γ-MAPS甲醇溶液,并將該溶液填入上步中預(yù)處理的干燥毛細(xì)管中,待填滿后,于60 ℃烘箱中放置12 h。取出毛細(xì)管后,用甲醇沖1 h, N2氣吹干,待用。接下來(lái),稱取GMA(15.0 mg)、PEGDA(30.0 mg)、甲醇(27.0 mg)和正癸醇(40.5 mg),混勻;然后加入AIBN(1.0 mg),混勻,N2氣吹5 min。取修飾后的50 cm長(zhǎng)毛細(xì)管,用記號(hào)筆在柱長(zhǎng)的35 cm處標(biāo)記,然后吸取該溶液至標(biāo)記處,兩端用橡皮塞密封,并于60 ℃下反應(yīng)12 h。待反應(yīng)完成后,取出毛細(xì)管柱,并依次用甲醇沖2 h、水沖1 h。

配置7%(體積分?jǐn)?shù))CAs溶液,并將該溶液通過HPLC泵注入上述毛細(xì)管整體柱中(入口端到檢測(cè)窗口),待完成后進(jìn)行電遷移。將有整體填料的毛細(xì)管一端放入盛有20 mmol/L NaOH的陰極溶液中,無(wú)整體材料的毛細(xì)管一端放入盛有20 mmol/L H3PO4的陽(yáng)極溶液中,調(diào)整CE儀器中的參數(shù)(12 kV,T(電壓從0 kV至12 kV所需時(shí)間)=360 s),待電流穩(wěn)定后,繼續(xù)加電5 min后斷電。將該毛細(xì)管柱兩端用橡皮密封,于70 ℃烘箱中放置20 h。然后,依次用去離子水沖1 h、甲醇沖1 h后,用N2氣吹干,待用。因此,所得到的固化pH梯度毛細(xì)管柱的pH順序?yàn)閺拿?xì)管入口端到檢測(cè)窗口逐漸減小,即靠近窗口端的pH小。當(dāng)在該等電聚焦柱上進(jìn)行樣品分離時(shí),pI小的蛋白質(zhì)樣品將先被檢測(cè)。

1.2.3HPC涂層毛細(xì)管柱的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[21]方法,取內(nèi)徑為75 μm的毛細(xì)管,分別經(jīng)純水、1.0 mmol/L NaOH溶液、甲醇各處理30 min,然后用N2吹干;將50 cm長(zhǎng)的該毛細(xì)管充滿5%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))HPC,于室溫下放置2 h;用N2將HPC吹出后,將毛細(xì)管置于60 ℃烘箱中,然后調(diào)整溫度到140 ℃,待溫度穩(wěn)定到140 ℃時(shí),保持25 min。之后將該毛細(xì)管取出,用氮?dú)獯?0 min,并于室溫下保存待用。

1.2.4M-IPG柱法采用1.2.2節(jié)中自制的M-IPG柱(有效長(zhǎng)度/總長(zhǎng):35 cm/50 cm,內(nèi)徑75 μm)進(jìn)行試驗(yàn),該柱在使用前用H2O沖洗10 min,實(shí)驗(yàn)在圖2所示的平臺(tái)中完成。在全柱進(jìn)樣過程(從入口端到檢測(cè)窗口)中,通過八通進(jìn)樣閥將供試品溶液注入定量環(huán)中,打開HPLC泵,將供試品溶液緩緩?fù)迫隡-IPG柱中,待基線發(fā)生明顯跳動(dòng)時(shí),切換八通進(jìn)樣閥和三通閥。之后,將該毛細(xì)管柱的出口端放入陽(yáng)極緩沖溶液(20 mmol/L H3PO4)中;選擇正模式(入口端與零極接觸,出口端與正極接觸),設(shè)置電壓為12 kV,聚焦時(shí)間分別為20 min(曲托珠單抗)和25 min(依那西譜),并打開微流注射泵,使其提供陰極緩沖溶液(20 mmol/L NaOH)。聚焦完成后,關(guān)閉高壓電源,再次切換八通進(jìn)樣閥和三通閥,將聚焦的蛋白質(zhì)區(qū)帶移向檢測(cè)窗口。

圖 2 在線毛細(xì)管等電聚焦平臺(tái)Fig. 2 Online capillary isoelectric focusing (cIEF) platform

1.2.5HPC涂層毛細(xì)管等電聚焦柱法

使用涂層熔融石英毛細(xì)管(有效長(zhǎng)度/總長(zhǎng):35 cm/50 cm,內(nèi)徑:75 μm);新制備的50 cm長(zhǎng)的HPC涂層毛細(xì)管使用前在距離出口端15 cm處燒制窗口,并用0.1%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù),下同)HPC的水溶液沖洗5 min。將出口端用特氟龍管與1.0 mL注射器相連,入口端放入1.5 mL的供試品EP管中,抽拉注射器,使供試品溶液填滿整根HPC涂層毛細(xì)管柱。然后,將該毛細(xì)管柱的出口端放入陰極緩沖溶液(20 mmol/L NaOH+0.1% HPC)中,將入口端放入陽(yáng)極緩沖溶液(20 mmol/L H3PO4+0.1% HPC)中。聚焦時(shí),聚焦電壓為18 kV,聚焦時(shí)間為15 min。樣品遷移時(shí),使用微流泵緩緩將聚焦樣品區(qū)推向檢測(cè)窗口。每?jī)纱芜M(jìn)樣間和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用0.1% HPC水溶液沖洗5 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPC涂層毛細(xì)管柱

2.1.1HPC涂層毛細(xì)管柱的系統(tǒng)適用性及其線性關(guān)系

為了考察新制備的HPC涂層毛細(xì)管柱的系統(tǒng)適用性及其線性,配制了pH 4.8～10.2范圍的4種模型蛋白質(zhì)(細(xì)胞色素c、胰蛋白酶原、肌紅蛋白、牛血清白蛋白)的供試品溶液進(jìn)行等電聚焦分離。結(jié)果如圖3所示,HPC涂層毛細(xì)管柱能夠?qū)?種模型蛋白質(zhì)進(jìn)行聚焦分離,且各峰的峰形良好。同時(shí)對(duì)4種模型蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)與其遷移時(shí)間進(jìn)行線性擬合,其線性相關(guān)系數(shù)為r=0.988 7(不理想)。在對(duì)該HPC涂層毛細(xì)管柱進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)時(shí)(實(shí)驗(yàn)條件:緩沖溶液為pH 9.76的10 mmol/L H3PO4;電壓為18 kV;λ=236 nm;樣品為0.2 mmol/L硫脲,Mt(遷移時(shí)間)=34.5 min(裸管時(shí),Mt=7.7 min)),發(fā)現(xiàn)該柱存在微小的電滲流;因此,推測(cè)該HPC涂層柱上的微小電滲流導(dǎo)致了上述不理想的相關(guān)系數(shù)。

圖 3 4種模型蛋白在羥丙基纖維素(HPC)涂層毛細(xì)管柱中的等電聚焦圖Fig. 3 Electropherogram of the four protein standards in the capillary coated with HPC (hydroxypropyl cellulose) EL (effective length)/TL(total length)=35/50; i. d.=75 μm; focusing voltage: 18 kV; focusing time: 15 min; u (flow rate) of mobilizing: 200 nL/min; detection wavelength: λ=280 nm. Samples: 0.2 mmol/L cytochrome c+0.2 mmol/L trypsin inhibitor+0.2 mmol/L myoglobin+0.2 mmol/L BSA (bovine serum albumin)+0.1% (w/v) HPC+3% (v/v) Pharmalyte 3-10. pI: isoelectric point.

2.1.2HPC涂層毛細(xì)管柱的重復(fù)性

在相同的條件下,HPC涂層毛細(xì)管柱連續(xù)進(jìn)樣6針的等電聚焦結(jié)果中,各模型蛋白質(zhì)的遷移時(shí)間的RSDs在0.8%～1.8%之間,表明該HPC涂層毛細(xì)管柱的重復(fù)性良好。

2.1.3HPC涂層毛細(xì)管柱對(duì)曲托珠單抗和依那西譜的等電聚焦分離

圖4是曲托珠單抗和依那西譜在HPC涂層毛細(xì)管柱上的等電聚焦分離圖。可以看出,曲托珠單抗聚焦成單一主峰,而依那西譜為多重峰的混合物,這種結(jié)果與文獻(xiàn)[22,23]報(bào)道的一致。

圖 4 曲托珠單抗和依那西譜在HPC涂層毛細(xì)管柱中的等電聚焦分離圖Fig. 4 Electropherogram of trastuzumab in the capillary coated with HPC Experimental conditions are the same as those in Fig. 3. Samples: 0.1 mmol/L trastuzumab+0.1% (w/v) HPC+3% (v/v) Pharmalyte 3-10, and 0.22 mmol/L etanercept+0.1% (w/v) HPC+3% (v/v) Pharmalyte 3-10.

2.1.4HPC涂層毛細(xì)管柱對(duì)曲托珠單抗和依那西譜pI的測(cè)定

圖 5 (a)曲托珠單抗和(b)依那西譜的pI測(cè)定的等電聚焦圖Fig. 5 Electropherogram of pI determination of (a) trastuzumab and (b) etanercept in the capillary coated with HPC Experimental conditions are the same as those in Fig. 3. Samples: a. 0.1 mmol/L trastuzumab+0.2 mmol/L cytochrome c (labeled as inner mark 1)+0.2 mmol/L myoglobin (labeled as inner mark 2)+0.1% (w/v) HPC+3% (v/v) Pharmalyte 3-10; b. 0.88 mmol/L etanercept+0.2 mmol/L myoglobin (labeled as inner mark 1)+0.2 mmol/L BSA (labeled as inner mark 2)+0.1% (w/v) HPC+3% (v/v) Pharmalyte 3-10.

由2.1.1節(jié)中HPC涂層毛細(xì)管柱的線性相關(guān)結(jié)果可知,如采用外標(biāo)法將會(huì)對(duì)實(shí)際結(jié)果影響較大,不適用對(duì)未知蛋白質(zhì)進(jìn)行pI測(cè)定。因此,根據(jù)2.1.3節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[24],在2.1.1節(jié)供試品溶液的基礎(chǔ)上分別加入已知pI的內(nèi)標(biāo)物(細(xì)胞色素c、肌紅蛋白、牛血清白蛋白,具體見圖5)。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,加內(nèi)標(biāo)蛋白質(zhì)后的曲托珠單抗和依那西譜的等電聚焦結(jié)果如圖5a和5b所示。通過對(duì)內(nèi)標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)與其遷移時(shí)間進(jìn)行線性相關(guān)性考察,可得到相應(yīng)的線性方程,并將曲托珠單抗的遷移時(shí)間代入該方程可得到其等電點(diǎn)為8.1,該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道(pI=7.76～8.49)一致[25];同理,可得到依那西譜各峰的pI范圍為5.3～6.7,其與文獻(xiàn)報(bào)道(pI=4.5～6.8)一致[23]。

圖 6 (a)處理的毛細(xì)管柱、(b)GMA-PEGDA整體柱和(c)M-IPG的掃描電鏡圖Fig. 6 Scanning electron micrographs of (a) a modified capillary, (b) GMA-PEGDA (glycidyl methacrylate-poly(ethyleneglycol) diacrylate) monolith, and (c) M-IPG

2.2 M-IPG柱

2.2.1M-IPG柱的表征

圖6是預(yù)處理毛細(xì)管柱、GMA-PEGDA整體柱和M-IPG的電鏡圖。從圖6a可知,修飾后的毛細(xì)管柱內(nèi)表面有一層薄薄的化合物,該薄層證明γ-MAPS被成功地鍵合到了毛細(xì)管的內(nèi)壁上。在GMA-PEGDA整體柱中(圖6b),球形單元聚集成大簇并且能看到明顯的整體柱的穿透孔隙。通過與圖6b相比,圖6c的球形單元有微小的變化,說明這些球形單元的表面鍵合上了CAs分子。

圖 7 (a)GMA-PEGDA型整體柱及(b)M-IPG柱的紅外光譜Fig. 7 Infrared spectrum of (a) the GMA-PEGDA monolith and (b) M-IPG column

此外,從GMA-PEGDA型整體柱及M-IPG柱的紅外光譜(見圖7)可以觀察到3 433 cm-1處聚合物νO-H和νN-H的吸收峰,以及1 735 cm-1處νC=O的吸收峰。圖7b與圖7a相比,紅外區(qū)域存在3個(gè)明顯的差異區(qū)。由于圖7b的M-IPG柱中有CAs的存在,νN-H(3 433 cm-1)和νC-N(1 631 cm-1)吸收譜帶得到增強(qiáng);此外,δC-H(1 385 cm-1)的吸收譜帶也被發(fā)現(xiàn)有增強(qiáng),這也進(jìn)一步證明了CAs已經(jīng)被固化在了該整體柱上。

圖 8 5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在M-IPG柱中的分離圖Fig. 8 Electropherogram of the five protein standards in the M-IPG column EL/TL=35/50; i. d.=75 μm; focusing voltage: 12 kV; focusing time: 25 min; u of mobilizing: 300 nL/min; detection wavelength: λ=280 nm. Samples: 0.2 mmol/L cytochrome c+0.2 mmol/L trypsinogen+0.2 mmol/L myoglobin+0.2 mmol/L carbonic anhydrase+0.2 mmol/L BSA+0.1% (w/v) HPC+3% (v/v) Pharmalyte 3-10.

2.2.2M-IPG柱的pH范圍和線性關(guān)系

為了驗(yàn)證自制的M-IPG柱的pH范圍,選擇pH 4.8～10.2范圍的5種模型蛋白質(zhì)混合物(牛血清白蛋白、碳酸酐酶、肌紅蛋白、胰蛋白酶原和細(xì)胞色素c)對(duì)其進(jìn)行pH范圍表征。該混合物的等電聚焦分離情況如圖8所示,自制的M-IPG柱能夠成功地對(duì)該蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行聚焦分離。同時(shí),根據(jù)這些蛋白質(zhì)的pI值與其出峰時(shí)間進(jìn)行線性擬合,其相關(guān)系數(shù)為0.985 1。

2.2.3M-IPG柱的重復(fù)性、耐受性及使用次數(shù)

用M-IPG柱連續(xù)對(duì)5種模型蛋白質(zhì)混合物(牛血清白蛋白、碳酸酐酶、肌紅蛋白、胰蛋白酶原和細(xì)胞色素c)進(jìn)樣6針,其等電聚焦的遷移時(shí)間的RSD少于7.6%。在12 kV的高壓電場(chǎng)中,M-IPG柱可以運(yùn)行不少于50次。當(dāng)超過該次數(shù)后,隨著聚焦次數(shù)的進(jìn)一步增加,M-IPG柱的聚焦效果會(huì)逐漸變差。當(dāng)更高電場(chǎng)被使用時(shí),M-IPG柱的使用次數(shù)也會(huì)顯著減少。

2.2.4M-IPG柱對(duì)曲托珠單抗和依那西譜的等電聚焦分離

如圖9所示,自制的M-IPG柱能夠?qū)η兄閱慰购鸵滥俏髯V進(jìn)行聚焦分離。在峰形上,曲托珠單抗仍為單一主峰,而依那西譜為多重峰,這表明該M-IPG柱能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)藥物進(jìn)行聚焦分離。

圖 9 曲托珠單抗和依那西譜在M-IPG柱中的分離圖Fig. 9 Electropherograms of trastuzumab and etanercept in the M-IPG column EL/TL=35/50; i. d.=75 μm; focusing voltage: 12 kV; focusing time: 20 min; u of mobilizing: 300 nL/min; detection wavelength: λ=280 nm. Samples: 0.3 mmol/L trastuzumab; 0.66 mmol/L etanercept.

2.2.5M-IPG柱對(duì)曲托珠單抗和依那西譜的pI的測(cè)定

圖10是M-IPG柱對(duì)含內(nèi)標(biāo)的曲托珠單抗和依那西譜的等電聚焦分離圖。根據(jù)兩個(gè)內(nèi)標(biāo)的相應(yīng)等電點(diǎn),可以分別測(cè)得曲托珠單抗(pI=8.1)和依那西譜(pI=4.9～6.8)的等電點(diǎn),該結(jié)果與HPC涂層柱的測(cè)定結(jié)果基本一致。

2.2.6M-IPG柱的分辨率

分辨率是色譜柱的重要性能參數(shù),決定著分離的好壞。從圖10b可知M-IPG柱的真實(shí)分辨度不超過0.1 pH。

圖 10 (a)曲托珠單抗和(b)依那西譜在M-IPG柱中pI測(cè)定的等電聚焦圖Fig. 10 pI determination of (a) trastuzumab and (b) etanercept in the M-IPG column EL/TL=35/50, i. d.=75 μm; focusing voltage: 12 kV; focusing time: 20 min (trastuzumab) and 25 min (etanerecept); mobilizing: u of mobilizing: 200 nL/min; detection wavelength: λ=280 nm. Samples: a. 0.3 mmol/L trastuzumab+0.2 mmol/L myoglobin (labeled as inner marker 1)+0.2 mmol/L cytochrome c (labeled as inner marker 2); b. 0.66 mmol/L etanercept+0.2 mmol/L BSA (labeled as inner marker 3)+0.2 mmol/L myoglobin (labeled as inner marker 4).

2.3 HPC涂層毛細(xì)管等電聚焦和M-IPG方法的比較

對(duì)平行試驗(yàn)的HPC涂層毛細(xì)管等電聚焦法和M-IPG法兩種聚焦方法進(jìn)行了對(duì)比。從實(shí)驗(yàn)操作的過程來(lái)看,HPC涂層毛細(xì)管等電聚焦法更加簡(jiǎn)單,主要表現(xiàn)在等電聚集毛細(xì)管柱的制備和聚焦實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,但是該方法的樣品制備過程復(fù)雜、消耗的樣品和載體兩性電解質(zhì)溶液更多、基線易發(fā)生漂移。對(duì)等電點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果、出峰寬度、分離度和分析總時(shí)間(聚焦時(shí)間+遷移時(shí)間)進(jìn)行了對(duì)比,結(jié)果見表1。在pI的對(duì)比中,HPC涂層毛細(xì)管等電聚焦法測(cè)定的結(jié)果與M-IPG法測(cè)定的結(jié)果基本一致,符合相關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)果。在峰寬的對(duì)比中,HPC涂層柱的峰寬略小,表明其分離能力相差不多。同時(shí),在分離的對(duì)比中,二者皆可滿足對(duì)該兩種蛋白質(zhì)類藥物等電點(diǎn)測(cè)定的要求。HPC涂層柱對(duì)依那西譜的分離更好,而M-IPG柱對(duì)曲托珠單抗的分離更好。另外,蛋白質(zhì)藥物聚焦后的峰形表明,該M-IPG柱的靈敏度較HPC涂層柱的高,基線更穩(wěn)定;在分析時(shí)間上,M-IPG柱對(duì)依那西譜的分析時(shí)間明顯較HPC涂層柱短。

表 1 HPC涂層毛細(xì)管法和M-IPG法的對(duì)比

* The separation degree is determined by the minimum separation degree between the sample and the internal standard; W1/2stands for peak width at half height. /: the item is not considered.

3 結(jié)論

本文嘗試用新制的M-IPG柱對(duì)蛋白質(zhì)藥物的pI值進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在單克隆抗體藥物和融合蛋白質(zhì)藥物的聚焦分離及pI測(cè)定中,新制的M-IPG柱與傳統(tǒng)的HPC涂層柱表現(xiàn)一致。在單點(diǎn)檢測(cè)平臺(tái)中,聚焦后的樣品遷移能夠在無(wú)電場(chǎng)作用下完成。以上結(jié)果都表明了該柱在進(jìn)一步構(gòu)建多維分離平臺(tái)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的潛力。特別是與質(zhì)譜聯(lián)用時(shí),M-IPG柱與HPC涂層柱相比具有更多的優(yōu)勢(shì):一是在電極緩沖液和樣品溶液中不添加CAs,提高靈敏度,避免離子源的污染;二是純水可以作為樣品溶劑,不會(huì)使蛋白質(zhì)變性,并允許分析物以其完整的形式被分離和檢測(cè)?；谶@種耦合技術(shù),可以提供目標(biāo)蛋白質(zhì)的pI和相對(duì)分子質(zhì)量信息,這將極大地促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)分析和生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。