聶雪梅, 董旭陽,2, 許秀麗, 張 峰*

(1. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所, 北京 100176; 2. 陜西科技大學(xué), 陜西 西安 710021)

1 乳制品生產(chǎn)加工監(jiān)控指標的概述

隨著生活水平的提高,我國乳制品消費需求與日俱增,中國奶業(yè)協(xié)會發(fā)布的首份《中國奶業(yè)質(zhì)量報告》顯示,2015年我國人均乳制品折合生鮮乳消費量36 kg,約為世界平均水平的1/3。由于消費需求劇增,液態(tài)奶的進口貿(mào)易量也與日俱增,據(jù)海關(guān)統(tǒng)計,2015年1月至11月,液體乳進口58.23萬噸,貨值5.89億美元,同比分別增長46.48%和37.79%[1,2]。但多數(shù)的進口液態(tài)奶無法實現(xiàn)源頭監(jiān)管,只能通過對終產(chǎn)品的監(jiān)測來保證其品質(zhì),2017年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶產(chǎn)品質(zhì)量與風(fēng)險評估創(chuàng)新團隊發(fā)布了《中國奶產(chǎn)品質(zhì)量安全研究報告》。該報告顯示,進口超高溫瞬時滅菌(UHT)奶的糠氨酸含量顯著高于國產(chǎn)UHT奶,并存在加熱過度和添加了復(fù)原乳的問題[3]。其中,糠氨酸就是乳制品加工過程中反映工藝條件的標志物,本文概述了目前國內(nèi)外乳制品加工過程中反映工藝條件標志物的研究概況,以期為完善我國相關(guān)標準和制度提供一定的理論基礎(chǔ)。

自20世紀90年代以來,歐盟乳制品化學(xué)專家組和國際乳品聯(lián)合會(IDF)提議通過研究乳品加工過程中化學(xué)標志物的變化來評估乳品的品質(zhì)[4]。在乳制品熱處理工藝控制領(lǐng)域中,也是采用監(jiān)測乳品中某種標志物的方法來控制乳品的質(zhì)量。近些年,比利時、法國、西班牙和瑞士等國采用監(jiān)測標志物含量的方法對UHT奶進行質(zhì)量調(diào)查?？钒彼嶙鳛槊览路磻?yīng)的產(chǎn)物,其含量可以很好地體現(xiàn)美拉德反應(yīng)程度,很多國際組織用糠氨酸含量來評價熱處理過程中牛奶的加熱程度。1992年,歐盟各國政府首次將糠氨酸的質(zhì)量分數(shù)作為鑒定液態(tài)乳品質(zhì)的一個重要指標,1996年國際奶業(yè)聯(lián)合會正式公布糠氨酸的檢測方法[5]。2005年,我國農(nóng)業(yè)部頒布了NY/T 939-2005《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》,首次將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物糠氨酸和乳果糖作為鑒定復(fù)原乳的標志物[6]。

2 反映工藝條件標志物的研究

近些年采用時間溫度標志物來監(jiān)控乳制品質(zhì)量的方法逐漸成為研究的熱點,方法通常包括兩種標志物:一種是熱不穩(wěn)定物質(zhì),降解物、變性物和鈍化物,例如乳清蛋白或酶等物質(zhì);一種是未經(jīng)加工處理的牛奶中不存在的新物質(zhì)成分,或僅痕量存在的物質(zhì),如乳果糖或美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的其他物質(zhì)。但方法影響因素太多,例如加工方式、pH值、儲存條件等多種因素,因此通常都是同時測定幾種標志物確定工藝條件。

Cattaneo等[7,8]對UHT奶和奶粉中乳果糖、糠氨酸、半乳糖基-β-吡喃酮和賴丙氨酸中的含量進行了研究,所有標志物的含量均能隨循環(huán)奶比例的增加而不同程度的增加,其中這4種標志物中賴丙氨酸是反應(yīng)儲存條件最靈敏的標志物。Pereda等[9]通過對羥甲基糠醛、自由巰基、糠氨酸、乳果糖和乳清蛋白變性標志物的研究,對超高壓均質(zhì)奶的熱損失進行了評估。

2.1 賴丙氨酸

2.1.1賴丙氨酸的研究情況

賴丙氨酸(lysinoalanine, LAL)作為晚期糖基化終產(chǎn)物的一種,其結(jié)構(gòu)式見圖1。1964年,Bohak在經(jīng)堿處理后的牛胰臟核糖核酸A中發(fā)現(xiàn)了LAL[10]。同年,Ziegler和Pathchornik分別在堿處理的羊毛和脫氧核糖核蛋白-核糖核酸酶(DNP-RnaseA)中發(fā)現(xiàn)了LAL[11]。富含蛋白質(zhì)的食品或食品原料在高溫或堿處理時易產(chǎn)生賴丙氨酸。賴丙氨酸的產(chǎn)生伴隨著食品中必需氨基酸的減少和外消旋化,使含蛋白質(zhì)的食品營養(yǎng)價值降低。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)賴丙氨酸的形成有很多因素,包括食品組分、食品加工方式、食品儲存條件等。同時在很多食品種類中測出了賴丙氨酸,Faist等[12]采用高效液相色譜法(LC)測定含有乳蛋白的食品,發(fā)現(xiàn)賴丙氨酸是一種能夠評估牛奶在加熱過程中是否摻假的靈敏標志物。Calabrese等[13]采用液相色譜-質(zhì)譜法對乳制品中賴丙氨酸進行測定,發(fā)現(xiàn)在原乳中并未檢測到賴丙氨酸,但在加工產(chǎn)品奶粉中均檢測到高含量的賴丙氨酸。

2.1.2賴丙氨酸的測定方法

20世紀70～80年代,國外學(xué)者開始致力于LAL檢測方法的研究,如薄層層析法(TLC)、氨基酸分析儀法和酯化?；瘍刹窖苌臍庀嗌V法以及液相色譜法等。Bosch等[14]對嬰幼兒谷物食品進行分析，用6 mol/L鹽酸在110 ℃下水解24 h,用硅烷化試劑N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)與賴丙氨酸進行衍生,形成N-叔丁基二甲基甲硅烷基(tBDMSi)衍生化合物,之后采用GC-FID定量,GC-MS定性。

2.2 糠氨酸

2.2.1糠氨酸的研究情況

糠氨酸(furosine)是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖2。近年來,糠氨酸常被用作判斷食品受熱程度的指標,在谷物、蛋類、肉制品、乳制品中均有應(yīng)用[15]。1992年歐盟各國政府將糠氨酸含量作為判斷液態(tài)奶成品質(zhì)量優(yōu)劣的一個重要指標,其檢測方法于1996年被IDF正式確認;歐盟和國際乳品聯(lián)合會分別于1996年和1998年提出以糠氨酸和乳果糖作為衡量復(fù)原乳的標志物[16]。蛋白質(zhì)暴露的賴氨酸與乳中游離乳糖發(fā)生反應(yīng),經(jīng)過酸水解最終形成游離的糠氨酸。加熱溫度和時間是影響牛奶中糠氨酸含量的兩個重要因素,在牛奶儲存過程中糠氨酸含量也會發(fā)生變化,另外蛋白質(zhì)的含量和種類、糖的含量、pH值及金屬離子都能影響糠氨酸的含量。

圖 2 糠氨酸的結(jié)構(gòu)式Fig. 2 Structure of furosine

2.2.2糠氨酸的測定方法

1990年,Resmini等[17]首次建立了高效液相色譜檢測牛奶中糠氨酸含量的測定方法。隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展,目前糠氨酸的檢測方法包括高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細管色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[18]。

圖 3 乳果糖的結(jié)構(gòu)式Fig. 3 Structure of lactulose

2.3 乳果糖

2.3.1乳果糖的研究情況

乳果糖(lactulose)又名4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖,是由半乳糖與果糖組成的二糖,在自然界中并不存在,其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖3。20世紀50年代首次發(fā)現(xiàn)在牛奶加熱過程中,在酪蛋白游離氨基酸基團催化條件下,乳糖的堿基發(fā)生異構(gòu)化生成一種合成雙糖——乳果糖[19]。乳果糖是乳糖在牛奶熱處理過程中發(fā)生堿基異構(gòu)的產(chǎn)物,源自果糖的異構(gòu)化分子,是評估奶熱處理程度的標志物。Schlimme等[20]指出乳果糖含量為100～400 mg/L和酸性可溶β-乳球蛋白高于50 mg/L可作為UHT奶的閾值參數(shù)。Corzo等[21]建議用糠氨酸的含量、早期美拉德反應(yīng)的程度以及乳果糖的含量來表征滅菌乳的真實性和質(zhì)量。

2.3.2乳果糖的測定方法

目前,乳果糖的測定方法主要有生物傳感器法、氣相色譜法、安培電流計法、離子交換色譜法、噻唑藍(MTT)顯色法、微分pH計法,以及普及性和穩(wěn)定性較強的酶解法、高效液相色譜法和更加簡單、快捷及成本較低的彌漫反射傅里葉變換紅外光譜學(xué)檢測法等[22-24]。

2.4 半乳糖基-β-吡喃酮

2.4.1半乳糖基-β-吡喃酮的研究情況

半乳糖基-β-吡喃酮(galactosyl-β-pyranone, GAP)是乳制品中乳糖通過美拉德反應(yīng)形成 1-脫氧鄰?fù)┖?，繼而產(chǎn)生的兩種糖基化產(chǎn)物之一。Cattaneo等[25]在飲用UHT奶中測出了半乳糖基-β-吡喃酮,研究表明,90%的半乳糖基-β-吡喃酮是超高溫滅菌過程本身造成的,它被證明是一種能夠區(qū)分是否過熱、循環(huán)奶濫用、過期飲用奶循環(huán)利用的非常靈敏的標志物。

2.4.2半乳糖基-β-吡喃酮的測定方法

目前,有關(guān)半乳糖基-β-吡喃酮測定方法的研究較少,Pellegrino等[26]提出用于評價GAP的無干擾高效液相色譜法,其前處理方法選用固相萃取法。

圖 4 羥甲基糠醛的結(jié)構(gòu)式Fig. 4 Structure of 5-hydroxymethylfurfural

2.5 5-羥甲基糠醛

2.5.15-羥甲基糠醛的研究情況

羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural, HMF)又名5-羥甲基-2-呋喃甲醛,其結(jié)構(gòu)式見圖4,主要由美拉德反應(yīng)和己糖酸性條件下脫水產(chǎn)生。在美拉德反應(yīng)的結(jié)束階段,脫氧鄰?fù)┨穷愔虚g產(chǎn)物進一步反應(yīng),在pH<7條件下,可生成5-羥甲基糠醛。5-羥甲基糠醛會改變牛乳的原有風(fēng)味,使產(chǎn)品的接受程度降低[27]。5-羥甲基糠醛經(jīng)過胺化反應(yīng),最終形成褐色的化合物,成為類黑精。食用過多的5-羥甲基糠醛可能會導(dǎo)致基因突變和引起DNA鏈斷裂,具有潛在的致癌風(fēng)險[28],歐盟食品安全委員會認為,每人每天攝入HMF的上限為1.6 mg[29]。

2.5.25-羥甲基糠醛的測定方法

牛奶中的5-羥甲基糠醛通常包括紫外分光光度法、衍生化分光光度法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法[30,31]。高萌[32]采用高效液相色譜法測定不同加工條件下羥甲基糠醛的含量變化,采用草酸進行水解,然后采用三氯乙酸進行蛋白質(zhì)沉淀凈化基質(zhì)。萬博愷等[33]利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法在5種市售醬油中鑒定出糠醛、2-乙基-1-己醇和5-甲基糠醛3種羥甲基糠醛衍生物。對醬油直接進行SPME萃取分析后發(fā)現(xiàn)其加標回收率不符合國標要求,最終選用蒸餾水將醬油稀釋5倍。

2.6 自由巰基

2.6.1自由巰基的研究情況

巰基是由一個硫原子和氫原子連接組成的一階原子團,結(jié)構(gòu)式為-SH。在乳品的氨基酸成分中,半胱氨酸和蛋氨酸是含硫的氨基酸,其中半胱氨酸殘基中的巰基是所有蛋白質(zhì)氨基酸殘基中最活潑的基團。在加熱過程中,氨基酸會發(fā)生一系列反應(yīng),半胱氨酸和蛋氨酸中的含硫組分也會發(fā)生變化,影響巰基的含量,造成乳制品風(fēng)味物質(zhì)的變化。宋慧敏[34]研究了熱處理對牛乳中巰基含量的影響,實驗結(jié)果表明,隨著加熱溫度和時間的增加,巰基含量整體呈下降趨勢。在加熱溫度偏低和時間較短的情況下,巰基的含量相對更高,這是由于加熱后巰基具有了活性,產(chǎn)生了硫化物和硫化氫,這些硫化物對牛乳的風(fēng)味影響較大,尤其是產(chǎn)生了令人不愉快的蒸煮味,這也是UHT乳比巴氏殺菌乳口感差的原因。

2.6.2自由巰基的測定方法

自由巰基的檢測方法主要有電化學(xué)和比色法[35]。林慧玨等[36]對幾種以比色法為原理的麥粉中自由巰基的測定方法進行了對比研究,發(fā)現(xiàn)環(huán)境pH值為6.5,緩沖液為以下4種成分3 mol/L尿素、0.001 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、2%(質(zhì)量分數(shù))十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.05 mol/L磷酸鈉時,是提取小麥粉中巰基的最佳條件。

2.7 堿性磷酸酶

2.7.1堿性磷酸酶的研究情況

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)不耐熱,最適的pH值為7.6～7.8,在63 ℃殺菌30 min,或在71～75 ℃殺菌15～30 s可鈍化。堿性磷酸酶在牛乳中比較重要,其含量因乳牛個體、泌乳期以及乳牛疾病等條件不同而異。Scharer磷酸酶試驗表明,利用堿性磷酸酶作為標志物,即使在巴氏殺菌乳中混入0.5%(v/v)的原料乳亦能被檢出[37]。歐盟法規(guī)EC No 853/2 004規(guī)定巴氏殺菌乳的加工條件為:高溫短時熱處理(至少72 ℃, 15 s)或低溫長時熱處理(至少63 ℃, 30 min)或任何能達到同等效果的其他溫度和時間的組合經(jīng)堿性磷酸酶測試后應(yīng)呈陰性[38]。因此堿性磷酸酶可以用來檢驗低溫巴氏殺菌法處理的消毒乳的殺菌程度是否完全。

2.7.2堿性磷酸酶的測定方法

對于堿性磷酸酶的測定,Vega-Warner等[39]用制備的多克隆抗體采用酶聯(lián)免疫吸附測定方法進行測定。我國《生鮮牛乳及其制品中堿性磷酸酶活度的測定方法》采用的是分光光度計法測定堿性磷酸酶[40]。

2.8 乳過氧化物酶

2.8.1乳過氧化物酶的研究情況

乳過氧化物酶(lactoperoxidase)是存在于乳汁中的一種血紅素蛋白,是牛乳中常見的成分之一,它可以鈍化一些有活性、具有同化作用的細菌酶,阻止細菌的新陳代謝作用及增殖能力,達到抑制或殺滅細菌的目的,從而延長生牛乳的保質(zhì)期[41]，同時對牛乳特有的嗜冷菌有抑制作用。乳過氧化物酶有較強的抑菌作用,在75～80 ℃失活,比堿性磷酸酶更具有熱穩(wěn)定性,可以通過測定乳過氧化物酶的活性間接了解乳制品的熱處理情況。在加熱溫度為85～90 ℃時,芽孢桿菌會熱休克形成孢子,影響乳制品的品質(zhì)。因此乳過氧化物酶的活性可以用來評估巴氏殺菌乳熱處理情況。[42]。

2.8.2乳過氧化物酶的檢測方法

目前,國內(nèi)外有關(guān)乳過氧化物酶檢測方法的研究較多,大多是基于顏色反應(yīng),利用酶促反應(yīng)原理,借助分光光度計測定酶活大小。常用的顯色劑有2,2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、愈創(chuàng)木酚、苯胺及鄰苯二胺等[43]。以苯胺類檢測乳過氧化物酶(LP)活性的方法雖然成本低,但是操作繁瑣,誤差較大,同時苯胺類物質(zhì)具有致癌性,導(dǎo)致其被新的顯色物質(zhì)所取代。TMB因其安全性和較高的敏感性,目前應(yīng)用越來越廣泛。謝莉等[44]利用酶促反應(yīng)原理,用2 mL無水乙醇溶解20 mg四甲基聯(lián)苯胺后,用檸檬酸緩沖液定容至100 mL,最后加入1 mg/mL辣根過氧化物酶(HRP)1 mL,混合均勻后制成顯色劑。方法以定量濾紙為載體,制成用于快速檢測過氧化氫的試紙條。該試紙條能夠在10 s內(nèi)對牛奶中的過氧化氫殘留進行半定量檢測,最低檢出限達到0.5 mg/L,并且操作簡單,價格低廉,十分適用于奶制品廠和基層奶站的現(xiàn)場檢測。

2.9 乳清蛋白

2.9.1乳清蛋白的研究情況

乳清蛋白(whey protein)是指溶解分散在乳清中的蛋白質(zhì),乳清蛋白也是乳制品中對熱最為敏感的蛋白質(zhì),即使在相對較低的溫度下,也易發(fā)生變性。乳清蛋白主要由β-乳球蛋白(占乳清蛋白的50%,下同)、α-乳白蛋白(25%)和牛血清白蛋白(6%)組成[45]。在乳品熱加工過程中,當溫度超過了蛋白質(zhì)的耐受溫度,其結(jié)構(gòu)、生物活性和溶解度都發(fā)生了變化,即蛋白質(zhì)熱變性。由于可溶性乳清蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)與熱處理的強度成反比,因此,可以根據(jù)可溶性乳清蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)來評估乳制品的熱處理強度[46]。研究發(fā)現(xiàn),熱加工的溫度和時間是影響乳清蛋白變性的重要因素,當熱加工條件為77.5 ℃加熱60 min或90 ℃加熱5 min時,乳清蛋白會徹底變性,巴氏殺菌乳清蛋白變性率達10%～20%,直接UHT乳的乳清蛋白變性率達40%～60%,間接UHT乳的乳清蛋白變性率達70%～90%[47,48]。Sakkas等[49]對生乳進行直接加熱,在120 ℃、30 s, 130 ℃、20 s, 140 ℃、15 s條件下,90%的β-乳球蛋白發(fā)生變性;在120 ℃、80 s, 130 ℃、40 s, 140 ℃、30 s條件下,99%的β-乳球蛋白發(fā)生變性。因此,在實際應(yīng)用中β-乳球蛋白可以作為乳品熱加工程度的標志物。IDF也對乳制品中的β-乳球蛋白提出限量要求,巴氏殺菌乳中β-乳球蛋白的最低限量為2 600 mg/L,高溫巴氏殺菌乳的最低限量為2 000 mg/L[50]。

2.9.2乳清蛋白的檢測方法

董學(xué)艷等[51]以凱氏定氮法為標準,對比了二喹啉甲酸法、福林-酚試劑法和考馬斯藍染色法3種方法對母乳中乳清蛋白含量的測定結(jié)果。實驗結(jié)果表明,福林-酚試劑法的檢測結(jié)果與凱氏定氮法的結(jié)果最相似,適于母乳中乳清蛋白的測定,并且該方法只需要4 mL母乳樣本,即可在1.5 h內(nèi)完成母乳中乳清蛋白的高通量快速檢測。楊懷榮等[52]采用高效液相色譜法測定豬乳中乳清蛋白含量,XbridgeTMSneild RP C18色譜柱用于α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和溶菌酶的分離檢測,Supelcosil C18色譜柱用于乳鐵蛋白和血清白蛋白的分離檢測。α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、溶菌酶和乳鐵蛋白的檢出限分別為0.6、1.0、0.3、0.2和4.0 mg/L。

3 結(jié)論

液態(tài)奶在加工過程中有兩種標志物，第一種是熱不穩(wěn)定物質(zhì)，例如堿性磷酸酶、乳過氧化物酶、乳清蛋白等。第二類是未經(jīng)加工處理的牛奶中不存在的新物質(zhì)成分，或僅痕量存在的物質(zhì)，包括賴丙氨酸、糠氨酸、乳果糖、半乳糖基-β-吡喃酮、5-羥甲基糠醛和自由巰基等。這類物質(zhì)由于其穩(wěn)定性較好，已經(jīng)成為國內(nèi)外的研究熱點。本文簡述了以上九種乳制品加工過程中標志物的國內(nèi)外研究概況，以期為完善我國乳制品加工過程中的監(jiān)管制度提供理論依據(jù)，保障消費者權(quán)益。