文/王海燕 姚 路 高 鵬 梁秀珍 崔秀秀 葛武鵬＊

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；2 陜西飛天乳業(yè)有限公司；3 陜西百躍羊乳集團(tuán)有限公司）

益生元，又稱益生素，在人體內(nèi)不會被腸道消化吸收，能夠選擇性刺激腸內(nèi)有益菌群生長增殖，提高菌體活性[1～3]。益生元除常見的菊粉（Inuline）、低聚異麥芽糖（IMO）、低聚果糖（FOS）等功能性糖類外，還包括蛋白質(zhì)水解物、天然植物及中草藥提取物等[4]。目前，菊粉[5，6]、低聚果糖[7]、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖（GOS）等功能性低聚糖被廣泛應(yīng)用于保健食品和飼料中[8～11]，已替代或部分替代蔗糖應(yīng)用到乳制品中[12～14]。

活性益生菌發(fā)酵飲品以獨(dú)特的風(fēng)味、色澤及多重營養(yǎng)保健功效，深受消費(fèi)者青睞。目前，市場主流活性益生菌發(fā)酵飲品多以牛乳為基料，尚未出現(xiàn)羊乳發(fā)酵飲品[15]。而現(xiàn)如今羊乳及其制品的營養(yǎng)特性已被越來越多的消費(fèi)者接受，漸成流行之勢，消費(fèi)者對羊乳制品種類的需求層次不斷提高[16，17]。本試驗(yàn)以副干酪乳桿菌為發(fā)酵劑，以活菌數(shù)為指標(biāo)，繪制其在羊乳中的生長曲線，并對低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖四種益生元進(jìn)行篩選和復(fù)配，得到增菌效果較好的益生元；同時(shí)對活性益生菌羊乳發(fā)酵飲品的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，為活性益生菌羊乳發(fā)酵飲品的開發(fā)提供理論支撐，以促進(jìn)羊乳制品種類多樣化發(fā)展，滿足消費(fèi)者需求。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

1．1．1 材料

西北農(nóng)林科技大學(xué)西農(nóng)薩能乳山羊畜牧基地生產(chǎn)的羊乳；新西蘭恒天然（中國）有限公司生產(chǎn)的脫脂乳粉；陜西百躍優(yōu)利士乳業(yè)有限公司提供的低聚果糖（純度≥95%）、菊粉（純度≥90%）、低聚半乳糖（純度≥55%）、低聚異麥芽糖（純度≥50%）；發(fā)酵劑為臺灣生合生物科技有限公司生產(chǎn)的副干酪乳桿菌。

1．1．2 試劑

MRS培養(yǎng)基；其余試劑均為分析純。

1．2 儀器與設(shè)備

立式蒸汽滅菌器、高速離心機(jī)、凈化工作臺、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、電熱恒溫水浴鍋、冰箱、發(fā)散乳化機(jī)、恒溫振蕩器、微量移液器、干燥箱。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1．3 方法

1．3．1 發(fā)酵劑的制備

制備滅菌脫脂乳培養(yǎng)基（12%脫脂乳粉，加入0.50‰葡萄糖，115 ℃、20 min高溫高壓滅菌），冷卻至40 ℃，在無菌條件下接種副干酪乳桿菌，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至凝乳。經(jīng)2～3 次活化使其活力充分恢復(fù)后，即可作為酸奶發(fā)酵劑。

1．3．2 副干酪乳桿菌生長曲線的測定

取制備好的副干酪乳桿菌以4%的接種量接種于殺菌脫脂羊乳（1 500 ×g、30 min離心脫脂）中，37 ℃培養(yǎng)77 h，每隔7 h取樣測定活菌數(shù)，繪制生長曲線?；罹鷶?shù)測定參考GB4789.35—2016[18]，利用無菌生理鹽水對發(fā)酵羊乳進(jìn)行梯度稀釋，通過預(yù)試驗(yàn)確定合適的稀釋梯度，取1.00 mL稀釋樣品于選擇性培養(yǎng)基以平板涂布法計(jì)數(shù)樣品中活菌數(shù)，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，結(jié)果取其平均值，單位為CFU/mL。

1．3．3 滴定酸度測定

根據(jù)GB5009.239—2016酸度測定方法[19]，用0.10 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定測定，單位以吉爾涅爾度（°T）表示。

1．3．4 益生元的增菌特性

脫脂羊乳中分別添加低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖四種益生元，添加的濃度依次為0.00%、0.70%、1.40%、2.10%、2.80%（m/v），殺菌后冷卻至37 ℃，接種副干酪乳桿菌，37 ℃恒溫發(fā)酵，在39 h、42 h、47 h時(shí)，測定活菌數(shù)，篩選增菌效果較好的益生元。

1．3．5 益生元復(fù)配

復(fù)配菊粉和低聚果糖，總添加量為1.40%，菊粉與低聚果糖的比例為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，以二者復(fù)配組為實(shí)驗(yàn)組，以單獨(dú)添加菊粉、低聚果糖組及不添加益生元組為空白對照組。37 ℃恒溫發(fā)酵，在39 h、42 h、47 h時(shí)，測定活菌數(shù)，確定最佳復(fù)配比例。

1．3．6 接種量確定

向已殺菌冷卻至37 ℃的脫脂羊乳中分別接入2%、3%、4%、5%、6%（v/v）副干酪乳桿菌，37℃培養(yǎng)42 h，測定活菌數(shù)和滴定酸度，確定最佳接種量。

1．3．7 最優(yōu)發(fā)酵條件確定

以益生元添加量、接種量及發(fā)酵時(shí)間為因素，以活菌數(shù)和滴定酸度為評價(jià)綜合指標(biāo)，采用L9（34）正交表，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，利用排隊(duì)評分法和公式評分法相結(jié)合的綜合評分法對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定活性益生菌羊乳發(fā)酵飲品最優(yōu)發(fā)酵工藝條件。正交試驗(yàn)各因素水平見表1。

1．4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用排隊(duì)評分法和公式評分法相結(jié)合的綜合評分法對結(jié)果進(jìn)行雙指標(biāo)分析，顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2．1 副干酪乳桿菌在羊乳中的生長曲線

由圖1可知，副干酪乳桿菌在脫脂羊乳中的生長曲線呈“S”型，菌體延滯期比較短，很快進(jìn)入對數(shù)生長期，活菌數(shù)迅速增加。當(dāng)發(fā)酵至21 h時(shí)，菌體開始進(jìn)入穩(wěn)定期。此菌的穩(wěn)定期長，為21～42 h，這一時(shí)間段，活菌數(shù)基本維持不變，42 h活菌數(shù)達(dá)到最大值，為1.87×109CFU/mL。42 h后，活菌數(shù)開始下降，逐漸進(jìn)入衰退期，乳酸積累過多，抑制菌體生長，發(fā)酵至77 h時(shí)，活菌數(shù)為1.23×109CFU/mL。

2．2 菊粉在羊乳中的增菌性能分析

試驗(yàn)探究菊粉增菌特性，以添加菊粉組為實(shí)驗(yàn)組，以不添加菊粉組為空白對照組，結(jié)果如圖2。隨著菊粉添加量的增加，活菌數(shù)先增加后減少，活菌數(shù)對菊粉有一定濃度依賴性。菊粉添加量對菌體生長有顯著性影響（P＜0.05）。當(dāng)菊粉添加量為1.40%時(shí)，活菌數(shù)最高，39 h、42 h、47 h分別達(dá)到2.21×109CFU/mL、2.47×109CFU/mL和2.31×109CFU/mL，空白對照組分別為1.84×109CFU/mL、1.95×109CFU/mL和1.85×109CFU/mL，實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)明顯高于空白對照組；且39～42 h時(shí)間內(nèi)，活菌數(shù)增長率比空白對照組高5.79%。結(jié)果表明，菊粉有較好的增菌作用，且最適添加量為1.40%。菊粉可以被乳酸菌發(fā)酵，具有雙歧桿菌增值因子的作用[20]，菊粉可以作為益生元調(diào)節(jié)腸道益生菌，同時(shí)還具有降血脂、降膽固醇、減肥和保護(hù)肝臟、預(yù)防癌癥和促進(jìn)維生素及礦物質(zhì)吸收等多種生理功能[21]。

圖1 副干酪乳桿菌在羊乳中生長曲線

圖2 菊粉添加量對發(fā)酵羊乳中活菌數(shù)的影響

圖3 低聚果糖添加量對發(fā)酵羊乳中活菌數(shù)的影響

2．3 低聚果糖在羊乳中的增菌性能分析

本試驗(yàn)探究低聚果糖增菌特性，以添加低聚果糖組為實(shí)驗(yàn)組，以不添加低聚果糖組為空白對照組，結(jié)果如圖3。低聚果糖添加量為0.70%～2.10%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)均高于空白對照組，當(dāng)添加量為2.80%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)低于空白對照組，可能是因?yàn)榈途酃翘砑恿窟^大，造成滲透壓偏高，導(dǎo)致菌體生長受到抑制。經(jīng)方差分析可知，不同低聚果糖的添加量對菌體生長有顯著影響（P＜0.05）。當(dāng)?shù)途酃翘砑恿?.40%時(shí)，發(fā)酵羊乳中活菌數(shù)最高，在39 h、42 h、47 h時(shí)，分別達(dá)到3.09×109CFU/mL、3.37×109CFU/mL和3.15×109CFU/mL，空白對照組分別為2.80×109CFU/mL、2.91×109CFU/mL和2.53×109CFU/mL；39～42 h時(shí)間內(nèi)，菌體增長率比空白對照組高5.13%，說明低聚果糖有較好的增菌作用。

低聚果糖添加量為1.40%時(shí)，在42～47 h內(nèi)，空白對照組活菌數(shù)減少10.69%，實(shí)驗(yàn)組僅減少7.10%，表明低聚果糖一定程度上有利于延緩菌體的衰亡。試驗(yàn)結(jié)果表明，低聚果糖有較好的增菌作用，且最適添加量為1.40%，并一定程度上有利于延緩菌體衰亡。在發(fā)酵羊乳中添加低聚果糖，可以延長產(chǎn)品貨架期，增強(qiáng)乳制品良好的口感風(fēng)味，增加水溶性可吸收鈣的含量，使乳制品更易消化吸收，提高發(fā)酵乳產(chǎn)品的功效[22]。

2．4 低聚半乳糖在羊乳中的增菌性能分析

試驗(yàn)探究低聚半乳糖增菌特性，以添加低聚半乳糖組為實(shí)驗(yàn)組，以不添加低聚半乳糖組為空白對照組，結(jié)果如圖4。低聚半乳糖添加量為0.70%～2.10%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)與空白對照組相比略有增加，添加量為2.80%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)低于空白對照組，可能是由于添加量過多，不利于菌體生長。經(jīng)方差分析可知，低聚半乳糖對菌體的生長無顯著影響（P＞0.05）。

當(dāng)?shù)途郯肴樘翘砑恿?.10%時(shí)，發(fā)酵羊乳中活菌數(shù)較高，在39 h、42 h、47 h時(shí)，分別達(dá)到2.29×109CFU/mL、2.55×109CFU/mL和2.50×109CFU/mL，空白對照組分別為2.17×109CFU/mL、2.40×109CFU/mL和2.32×109CFU/mL，39～42 h時(shí)間內(nèi)，活菌數(shù)增長率比空白對照組高0.76%。結(jié)果表明，低聚半乳糖有一定增菌作用，且最適添加量為2.10%，但促進(jìn)作用不如菊粉和低聚果糖明顯。

圖4 低聚半乳糖添加量對發(fā)酵羊乳中活菌數(shù)的影響

圖5 低聚異麥芽糖添加量對發(fā)酵羊乳中活菌數(shù)的影響

2．5 低聚異麥芽糖在羊乳中的增菌性能分析

試驗(yàn)探究低聚異麥芽糖增菌特性，以添加低聚異麥芽糖組為實(shí)驗(yàn)組，以不添加低聚異麥芽糖組為空白對照組，結(jié)果如圖5。實(shí)驗(yàn)組中低聚異麥芽糖添加量為1.40%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)略高于空白對照組，在39 h、42 h、47 h時(shí)，分別為2.31×109CFU/mL、2.70×109CFU/mL和2.33×109CFU/mL，對照組分別為2.30×109CFU/mL、2.69×109CFU/mL和2.16×109CFU/mL；39～42 h時(shí)間內(nèi)，活菌數(shù)增長率與空白對照組基本一致。當(dāng)添加量為2.80%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)低于空白對照組，可能是因?yàn)樘砑恿窟^大，造成滲透壓偏高，不利于菌體生長。方差分析可知，低聚異麥芽糖的添加量對活菌數(shù)有顯著影響（P＜0.05），但增菌效果不如菊粉和低聚果糖明顯。

2．6 低聚糖復(fù)配

由以上試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菊粉與低聚果糖能較好的促進(jìn)發(fā)酵羊乳中菌體增殖，故選擇菊粉與低聚果糖進(jìn)行復(fù)配，觀察二者共同作用的增菌效果是否優(yōu)于單獨(dú)使用。

由圖6可以看出，單獨(dú)添加菊粉、低聚果糖或者二者復(fù)配添加后，活菌數(shù)均高于不添加任何益生元的空白對照組，且復(fù)配比例對活菌數(shù)有顯著影響（P＜0.05）。菊粉與低聚果糖的比例為9:1時(shí)，在42 h活性益生菌羊乳發(fā)酵飲料中的活菌數(shù)達(dá)到最大值，為2.86×109CFU/mL。

2．7 接種量對菌體生長的影響

由圖7可知，隨著接種量的增加，活菌數(shù)不斷增加，滴定酸度不斷增大，這是因?yàn)榻臃N量越多，乳酸菌在乳中定植生長越快，產(chǎn)酸速度也越快，接種量由2%增加至4%時(shí)，活菌數(shù)迅速增加，超過4%后，活菌數(shù)增加趨勢減小，經(jīng)方差分析可知，接種量對發(fā)酵羊乳中副干酪乳桿菌菌體數(shù)量和滴定酸度有顯著影響（P＜0.05）。接種量超過5%時(shí)，發(fā)酵乳中乳清析出現(xiàn)象隨著接種量的增加而加劇，綜合考慮，試驗(yàn)選擇3%、4%、5%三個水平進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，確定最佳接種量。

圖6 菊粉/低聚果糖復(fù)配對發(fā)酵羊乳中活菌數(shù)的影響

圖7 接種量對發(fā)酵羊乳中活菌數(shù)和滴定酸度的影響

2．8 最佳發(fā)酵條件確定

以接種量、發(fā)酵時(shí)間及益生元為單因素，以活菌數(shù)和滴定酸度為評價(jià)綜合指標(biāo)，試驗(yàn)采用L9（34）正交表，進(jìn)行三因素三水平的正交設(shè)計(jì)，確定最佳發(fā)酵工藝條件，結(jié)果如下。

由表2和表3可知，益生元添加量（A）、接種量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）三個因素對試驗(yàn)綜合評分影響的主次順序?yàn)橐嫔砑恿浚景l(fā)酵時(shí)間＞接種量，即益生元添加量對綜合評分有極顯著影響（P＜0.01），為決定性因素；其次為發(fā)酵時(shí)間和接種量，二者對綜合評分有顯著性影響（P＜0.05），其中接種量的影響最小?；钚砸嫔蛉榘l(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵條件是A2B2C1，即益生元添加量為1.50%，接種量為4%，發(fā)酵時(shí)間為40 h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2．9 正交試驗(yàn)驗(yàn)證

對正交試驗(yàn)分析得到的最優(yōu)發(fā)酵組合A2B2C1，進(jìn)行多次重復(fù)性（n=3）驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，發(fā)酵羊乳中活菌數(shù)達(dá)到1.91×109CFU/mL、滴定酸度為138.90 °T（P＞0.05），且凝乳均勻細(xì)膩，香味濃郁，故活性益生菌羊乳發(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵工藝優(yōu)化條件是A2B2C1，即益生元添加量為1.50%，接種量為4%，發(fā)酵時(shí)間為40 h。

表3 方差分析

3 小結(jié)

3．1 發(fā)酵劑副干酪乳桿菌在羊乳中發(fā)酵42 h時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值，為1.87×109CFU/mL。

3．2 以活菌數(shù)為指標(biāo)，研究低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖四種益生元的增菌特性，結(jié)果表明，四種益生元均能促進(jìn)乳酸菌的體外生長增殖，增殖效果較好的是菊粉和低聚果糖，且最適添加量均為1.40%。

3．3 在菊粉和低聚果糖混合制的復(fù)合益生元研究中，發(fā)現(xiàn)菊粉與低聚果糖復(fù)配比例為9:1時(shí)，對增菌作用較為明顯，且優(yōu)于單獨(dú)使用。

3．4 發(fā)酵工藝優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，以益生元添加量、接種量、發(fā)酵時(shí)間為因素，經(jīng)正交優(yōu)化和驗(yàn)證試驗(yàn)確定活性益生菌羊乳發(fā)酵飲品的最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)是：益生元添加量為1.50%，接種量為4%，發(fā)酵時(shí)間為40 h，此條件下，發(fā)酵羊乳中活菌數(shù)達(dá)到1.91×109CFU/mL。