文/邵鉞馨 鐘玉玲 李仲陽(yáng) 史懷平

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

薩能奶山羊是世界上優(yōu)秀的奶山羊品種之一，多作為奶山羊品種改良的父本。人們對(duì)羊奶需求量的增長(zhǎng)，促使我國(guó)羊奶產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展。截至2016年底，僅陜西省奶山羊存欄量就達(dá)到220 萬只[1]。隨著選種、選育技術(shù)的不斷發(fā)展，薩能奶山羊的精液品質(zhì)成為配種工作中一項(xiàng)重要指標(biāo)，精液的保存和稀釋在很大程度上影響精液品質(zhì)。近年來，有關(guān)抗氧化劑對(duì)凍精保存效果的研究較多?；裘簦?018） 研究表明，在絨山羊精液稀釋液中添加0.5 mg/mL的褪黑素，較對(duì)照組的精子活率提高8.5%，頂體完整率提高24.73%[2]。王艷華（2016）研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍稀釋液中添加1.0 mg/mL的番茄紅素解凍后，精子活率為52.04%，在稀釋液中添加10 μg/mL的α-硫辛酸，精子活率為50.71%，添加抗氧化劑的試驗(yàn)組較對(duì)照組能夠顯著提高精液品質(zhì)[3]。

本試驗(yàn)采用的大豆異黃酮從豆科植物中提取，具有抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力作用，其分子結(jié)構(gòu)上含有多個(gè)酚羥基，可以與自由基結(jié)合，達(dá)到消除自由基的功效，已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。研究表明，大豆異黃酮不僅能夠增加動(dòng)物的采食量[4]，對(duì)機(jī)體的繁育性能也有積極影響。郭振慧等（2016） 研究表明，在公兔日糧中添加6 mg/kg大豆異黃酮，可以提高公兔抗熱應(yīng)激能力，緩解熱應(yīng)激造成的睪丸損傷[5]。范覺鑫等（2012）研究表明，在香豬日糧中添加250 mg/kg大豆異黃酮能夠促睪丸的生長(zhǎng)發(fā)育，睪丸組織中α-葡萄糖苷酶含量較對(duì)照組增加137.99 U/L[6]。但目前，在薩能種公羊精液稀釋液中添加大豆異黃酮對(duì)精液品質(zhì)的影響鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在探究在種公羊精液稀釋液中外源添加大豆異黃酮對(duì)精液常溫保存的影響，為大豆異黃酮在精液保存的實(shí)際應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

1．1．1 試驗(yàn)精液

所用精液來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)畜禽生態(tài)試驗(yàn)站薩能羊原種場(chǎng)的成年薩能種公羊。

1．1．2 主要試劑

三羥甲基-氨基甲烷（Tris）、檸檬酸、葡萄糖、果糖、海藻糖、維生素C（Vc）、還原型谷胱甘肽（GSH）、牛血清白蛋白（BSA）、三磷酸腺苷（ATP）、甘油、抗生素。

1．1．3 儀器設(shè)備

分析天平、微量移液器、電磁攪拌器、恒溫箱、高壓滅菌鍋、顯微鏡等。

1．2 試驗(yàn)準(zhǔn)備

1．2．1 稀釋液配方

利用本實(shí)驗(yàn)室發(fā)明專利（常溫稀釋液“奶山羊精液常溫及低溫保存稀釋液”；專利號(hào)碼：ZL201310529785.7），主要成分包括：Tris 300 mmol/L，檸檬酸94.7 mmol/L，果糖30 mmol/L，海藻糖225 mmol/L，Vc 5 g/L，GSH 5 mmol/L，BSA 3 g/L，ATP 1.2 mmol/L，復(fù)合抗生素。

1．2．2 靜液采集

采精一般在早上8:00—10:00進(jìn)行，采精前選擇發(fā)情狀況良好的母羊作為臺(tái)羊，選用假陰道法對(duì)試驗(yàn)種公羊進(jìn)行采精，采集后及時(shí)檢測(cè)并記錄采精量及精液pH值，然后4 倍稀釋做好標(biāo)簽放入37 ℃保溫杯中，整個(gè)采精過程保證保溫杯水溫穩(wěn)定在37 ℃，采精完成后于30 min內(nèi)將精液帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)品質(zhì)指標(biāo)。

1．2．3 精液稀釋

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分為3 組，每組稀釋液中大豆異黃酮濃度分別為0 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L。取1 mL稀釋液于5 mL離心管中，置入恒溫水浴鍋至37 ℃，與0.3 mL等溫的鮮精緩慢混勻，用紗布包裹放入17 ℃恒溫箱，每12 h輕輕翻動(dòng)1 次防止精子沉積，每組設(shè)計(jì)5個(gè)重復(fù)。

1．3 精液保存效果檢測(cè)

1．3．1 有效存活時(shí)間

精液保存在17 ℃恒溫箱中，每12 h檢測(cè)1 次活力指標(biāo)，當(dāng)精子活率低于0.6時(shí)默認(rèn)為輸精效果較差，記錄精子活率低于0.6的保存時(shí)間。

1．3．2 精子活率

精子活率的測(cè)定參照胡傳水[7]對(duì)豬精液的計(jì)數(shù)方法。

1．3．3 精子質(zhì)膜和頂體完整性

質(zhì)膜完整性：使用試劑盒進(jìn)行低滲腫脹試驗(yàn)（Hypoosmotic Swelling Test，HOST），質(zhì)膜完整的精子會(huì)吸水膨脹產(chǎn)生彎尾現(xiàn)象，質(zhì)膜不完整的精子形態(tài)不會(huì)發(fā)生變化，400 倍顯微鏡下統(tǒng)計(jì)彎尾率，計(jì)數(shù)至少200 個(gè)精子，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

頂體完整性：依照精子快速染色試劑盒方法，制作涂片并完成染色，置于油鏡下觀察，頂體完整的精子可以觀察到明顯的透明帶結(jié)構(gòu)，計(jì)數(shù)至少200 個(gè)精子，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1．3．4 精子T-AOC、MDA、ROS水平檢測(cè)

總抗氧化能力（T-AOC）、氧化應(yīng)激產(chǎn)物丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量采用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1．4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用GraphPad Prism 5.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，最終試驗(yàn)結(jié)果表示為“平均數(shù)（x）±標(biāo)準(zhǔn)差（s）”。

圖 1 大豆異黃酮濃度對(duì)成年公羊精子有效存活時(shí)間的影響

2 結(jié)果與分析

2．1 大豆異黃酮對(duì)精液常溫保存效果的影響

由圖1可知，基礎(chǔ)稀釋液中添加大豆異黃酮至濃度為0.05 mmol/L時(shí)，精子有效存活時(shí)間為（31.42±2.97）h，較對(duì)照組存活時(shí)間增加12.89 %，但差異不顯著（P＞0.05）?；A(chǔ)稀釋液中添加大豆異黃酮至濃度為0.10 mmol/L時(shí)，精子有效存活時(shí)間為（30.6±4.29）h，與0.05 mmol/L大豆異黃酮組和對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

表 1 在常溫保存條件下添加大豆異黃酮對(duì)成年公羊精子活率的影響

表 2 常溫保存條件下添加大豆異黃酮對(duì)成年公羊精子結(jié)構(gòu)完整性的影響

2．2 大豆異黃酮對(duì)精子活率的影響

由表1可知，試驗(yàn)組與對(duì)照組在精子保存前2 天時(shí)，精子活率差異不顯著（P＞0.05）。精子保存第3～4天時(shí)，0.05 mmol/L大豆異黃酮組的精子活率與對(duì)照組和0.10 mmol/L大豆異黃酮差異不顯著（P＞0.05）；0.10 mmol/L大豆異黃酮組的精子活率與對(duì)照組差異性顯著（P＜0.05）。在第5天，大豆異黃酮組的精子活率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2．3 大豆異黃酮對(duì)精子結(jié)構(gòu)完整性的影響

由表2可知，精液保存第3天時(shí)，0.10 mmol/L大豆異黃酮組的質(zhì)膜完整性顯著高于對(duì)照組，提高了2.51 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05）；在第4天后，試驗(yàn)組的質(zhì)膜完整性均顯著高于對(duì)照組，0.10 mmol/L大豆異黃酮組提高了3.29 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05）。精液保存期間，大豆異黃酮組的頂體完整性與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

2．4 大豆異黃酮對(duì)精液抗氧化指標(biāo)的影響

精液放于17 ℃恒溫箱的第3天，檢測(cè)精液的抗氧化指標(biāo)。隨著大豆異黃酮濃度的增加，精液的抗氧化能力增強(qiáng)。由圖2可知，大豆異黃酮組T-AOC水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。精液中MDA水平與大豆異黃酮濃度成反比，各組間MDA水平差異顯著，0.10 mmol/L大豆異黃酮組低于0.05 mmol/L大豆異黃酮組，0.05 mmol/L大豆異黃酮組低于對(duì)照組（P＜0.05）。大豆異黃酮組ROS水平顯著低于對(duì)照組，但2 個(gè)大豆異黃酮組間差異性不顯著（P＞0.05）。

3 討論

精子在常溫環(huán)境下活動(dòng)性強(qiáng)，易產(chǎn)生氧化損傷。因此，外源添加抗氧化劑成為精液稀釋液保存的研發(fā)重點(diǎn)。研究表明，多種不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)位于精子質(zhì)膜上，質(zhì)膜完整性在精子獲能及頂體反應(yīng)中有重要作用。精子頂體內(nèi)膜存在大量頂體酶原，酶原能夠促使精卵結(jié)合，頂體的完整性決定了進(jìn)行精卵結(jié)合的能力。同時(shí)，延長(zhǎng)精液常溫保存時(shí)間為跨區(qū)域引種提供保障，提高精液在人工授精過程中的有效利用率。大豆異黃酮是一種植物性雌激素，高劑量添加于稀釋液中不易溶解，導(dǎo)致關(guān)于其對(duì)精液保存效果報(bào)道較少，降低了大豆異黃酮在動(dòng)物保種工作中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本試驗(yàn)在精液稀釋液中添加不同濃度的大豆異黃酮，分析精液常規(guī)指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其能夠降低精液在常溫保存過程中所受的損傷，改善精液品質(zhì)。

圖 2 大豆異黃酮對(duì)成年奶山羊精液抗氧化水平的影響

3．1 大豆異黃酮對(duì)精液常溫常規(guī)指標(biāo)的影響

目前，關(guān)于抗氧化劑對(duì)家畜精液保存影響的報(bào)道不一。劉琦等（2015）在常溫保存基礎(chǔ)稀釋液中添加不同體積的GSH，每隔24 h觀察精子活力，結(jié)果表明1 mmol/L和5 mmol/L GSH常溫有效存活時(shí)間達(dá)到5 天，顯著高于對(duì)照組保存時(shí)間[8]。何錦等（2015）在豬精液常溫保存稀釋液添加10 mol/L五味子乙素，精液在第5天仍可進(jìn)行人工輸精要求[9]。徐文慧等（2017）探究抗氧化劑對(duì)馬精液低溫保存效果發(fā)現(xiàn)，添加?；撬崂鋬霰４? 天后，精子活率為78%[10]。任子利等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，外源添加5.0 g/L維生素C試驗(yàn)組與對(duì)照組藏豬精子畸形率差異性顯著，畸形率降低10 %，精子活率為69%[11]。有研究表明，不同稀釋液對(duì)種公羊精液保存時(shí)間有差異[12]。本試驗(yàn)在羊精液稀釋液中添加大豆異黃酮至濃度為0.05 mmol/L、0.10 mmol/L時(shí)，試驗(yàn)組的精液保存時(shí)間均高于對(duì)照組，但組間差異不顯著。試驗(yàn)第2天，精子活率低于0.6，但0.10 mmol/L大豆異黃酮組的精子活率下降趨勢(shì)平緩。精液保存至第3～4天時(shí)，0.10 mmol/L大豆異黃酮組的精子活率顯著高于對(duì)照組，說明大豆異黃酮對(duì)精子活率有保護(hù)作用，能夠有效緩解精子在常溫保存過程中活率下降的現(xiàn)象。與其他試驗(yàn)結(jié)果不同的是，薩能奶山羊精液存活時(shí)間明顯較短，分析原因可能是：其一，試驗(yàn)動(dòng)物不同，羊的精子遺傳特性與生理學(xué)特征可能有其特殊性；其二，抗氧化劑不同，大豆異黃酮不同于其它抗氧化劑，可能對(duì)精液抗氧化效果影響小，而且有可能存在奶山羊精液對(duì)大豆異黃酮不敏感的因素。此外，還可能與添加大豆異黃酮的濃度有關(guān)，在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)進(jìn)行0.25 mmol/L、0.50 mmol/L水平對(duì)精液的影響。

精液在保存過程中，會(huì)受到溫度、pH值、滲透壓等影響，造成精子結(jié)構(gòu)完整性被破壞。毛冉等（2016） 研究發(fā)現(xiàn)，每100 mL杜泊羊精液稀釋液中添加5 mL卵黃保存，與對(duì)照組的頂體完整性和質(zhì)膜完整性相比差異性顯著，隨著卵黃添加量的增多，保存效果越明顯，保存72 h時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，添加15 mL卵黃的稀釋液可使精子質(zhì)膜完整性達(dá)到35%以上，頂體完整性達(dá)到68.3%左右[13]。李方舟等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液添加20 mg/L褪黑素對(duì)薩?？斯蚓旱蜏乇４妫? 天時(shí)質(zhì)膜完整率高出對(duì)照組5.98%，頂體完整率比對(duì)照組高4.15%[14]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，精液保存第3天時(shí)，0.10 mmol/L大豆異黃酮組比對(duì)照組的質(zhì)膜完整性高出2.51%。雖然試驗(yàn)結(jié)果顯示，頂體完整性與對(duì)照組差異性不顯著，但是可以看出在稀釋液中添加大豆異黃酮對(duì)精子結(jié)構(gòu)完整性有促進(jìn)效果。

3．2 大豆異黃酮對(duì)精液抗氧化指標(biāo)的影響

精液中T-AOC水平高低，能夠反應(yīng)抗氧化劑結(jié)合活化氧自由基能力；MDA水平是脂質(zhì)過氧化程度的體現(xiàn)[15]；ROS的水平代表活化氧的含量，其產(chǎn)生過程復(fù)雜，ROS含量的增多會(huì)破壞機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)。本試驗(yàn)中，0.10 mmol/L大豆異黃酮組的T-AOC水平顯著增強(qiáng)，其余氧化指標(biāo)與對(duì)照組差異性顯著，0.10 mmol/L大豆異黃酮組與對(duì)照組相比，精液的T-AOC水平提高48.25%、MDA水平下降47.93%。Naijian等（2013）試驗(yàn)表明，添加1 mmol/L抗氧化丁基甲苯不能影響精子頂體完整性，但能極顯著降低MDA水平，改善山羊精子活率[16]。Khalifa等（2010）研究證明，添加0.6 mmol/L抗氧化丁基甲苯能夠維持解凍后50%左右的精子活率和較高的繁殖率[17]。Li等（2017）研究表明，保存杜洛克公豬精液時(shí)，添加5 mmol/L?；撬崮軌蚓S持T-AOC水平，降低脂質(zhì)過氧化物水平，延長(zhǎng)精液保存時(shí)間[18]。這與本試驗(yàn)獲得的精液保存效果類似，精液在保存過程中抗氧化能力降低，外源添加適量大豆異黃酮能夠增強(qiáng)精子抗氧化酶活性，從而提升T-AOC水平，降低MDA和ROS水平，達(dá)到精液長(zhǎng)時(shí)間保存的效果。

4 結(jié)論

在薩能種公羊精液常溫保存過程中，稀釋液中添加大豆異黃酮濃度至0.10 mmol/L時(shí)，可有效提高精子活率，保護(hù)精子結(jié)構(gòu)完整性，而且可顯著提高精液抗氧化水平，對(duì)精液常溫保存具有一定的積極作用。