王晴　曹穩(wěn)根　錢玉梅　李紅俠　汪慧文

摘要：以羅非魚魚皮為材料，利用醋酸和胃蛋白酶分提取膠原蛋白，通過紫外光譜、紅外光譜、吸油性、保水性、溶解性等對其理化特性進行比較分析.結果表明兩者在230nm左右出現(xiàn)最大紫外吸收峰，均屬典型的膠原蛋白;紅外顯示兩種蛋白結構相似;酶溶性膠原蛋白吸油性優(yōu)于酸溶性膠原蛋白，且兩者都有很好的保水性和溶解性.以期為膠原蛋白的提取及應用提供理論依據(jù).

關鍵詞：羅非魚;提取;膠原蛋白;特性

中圖分類號：TS201.2? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2019）09-0090-03

羅非魚是世界第三大養(yǎng)殖品種，在我國養(yǎng)殖量居第二[1].目前，其主要用來生產(chǎn)冷凍魚肉片，因此會留下60%～70%下腳料，包括魚皮、魚頭、魚鰭和魚骨，其中魚皮中含有豐富的膠原蛋白[3]，對其進行有效利用，避免浪費的同時還可減少環(huán)境污染[2].

膠原蛋白是哺乳動物體內含量最多、分布最廣的功能性蛋白質，它構成了動物皮的支持組織，具有增強機體皮膚組織細胞儲水能力、增強肌膚彈性、保持皮膚柔軟、使皮膚細嫩等生理功能，其理化性質和生物學特性優(yōu)良，在醫(yī)學、食品工業(yè)和化妝品等領域應用廣泛.膠原蛋白的提取分離方法包括熱水提法、酸提法、酶提法等[4].

醋酸酸法和胃蛋白酶酶法提取膠原蛋白，通過紫外光譜、紅外光譜以及吸油性、保水性、溶解性測定對兩者理化特性進行分析比較，以期為膠原蛋白的提取及應用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

羅非魚魚皮產(chǎn)自江蘇連云港飛凡水產(chǎn)公司;羥脯氨酸購于Sigma公司;氯化鈉、異丙醇、胃蛋白酶、正丙醇、無水乙酸鈉、乙酸、硫酸銅、檸檬酸購于上海國藥，均為分析純.

1.2 試驗儀器

SC-3612離心機（江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司）、ST3100酸度計（奧豪斯儀器有限公司）、SP-723分光光度計（光譜儀器有限公司）、Nicolet IS50傅立葉變換紅外光譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）等.

1.3 試驗方法

1.3.1 魚皮預處理

將魚皮烘干，粉碎，5%氯化鈉浸泡6h，蒸餾水洗滌數(shù)次并瀝干水分，置于異丙醇、乙醚與蒸餾水體積比為2：2：8的溶液中浸泡6h，蒸餾水洗滌數(shù)次后瀝干水分并在55℃恒溫干燥箱中烘干備用[5].

1.3.2 酸溶性膠原蛋白（ASC）的制備

按料液比1：20加入預處理所得魚皮和0.5mol/L乙酸，磁力攪拌24小時，離心得到上清，加入氯化鈉使得濃度至0.9mol/L，靜置過夜.6000r/min離心20min，舍棄上清，沉淀加入10倍體積0.1mol/L的乙酸進行溶解，并在10倍體積的0.1mol/L乙酸溶液中透析12h，每4h換一次透析液，蒸餾水透析至中性，得到酸溶性膠原蛋白提取液，冷凍干燥得到酸溶性膠原蛋白（ASC）[6].

1.3.3 酶溶性膠原蛋白（PSC）的制備

將預處理后的魚皮按料液比1：20加入0.5mol/L乙酸中，并加入魚皮質量2%的胃蛋白酶.磁力攪拌提取24h，離心取上清，加入一定質量的氯化鈉至上清液氯化鈉溶液最終濃度為0.9mol/L，靜置過夜.6000r/min離心20min，棄上清，加入10倍體積的0.1mol/L的乙酸中溶解沉淀，并在10倍體積的0.1mol/L乙酸溶液中透析12h，每4h換一次透析液，蒸餾水透析至中性，得到酶溶性膠原蛋白提取液，冷凍干燥得到酶溶性膠原蛋白（PSC）[6].

1.3.4 膠原蛋白得率計算

膠原蛋白得率/%=（凍干膠原蛋白粗品質量/提取用魚皮質量）×100（1）

1.3.5 紫外吸收光譜分析

將酸溶性膠原蛋白提取液和酶溶性膠原蛋白提取液，以0.5mol/L的醋酸作為對照，在200～400nm波長范圍內用紫外可見分光光度計測定其吸光度，得到膠原蛋白紫外吸收曲線[7].

1.3.6 紅外光譜分析

采用傅里葉紅光譜儀對ASC和PSC進行紅外掃描，分別將適量的ASC和PSC與KBr混合壓片，在400～4000cm-1波數(shù)區(qū)間掃描，分辨率4cm-1[8，16].

1.3.7 溶解性測定

取一定質量ASC、PSC溶于0.5mol/L醋酸中，使得濃度為5mg/mL.取5mL分別調至pH為4、5、6、7、8、9，保持pH值不變，蒸餾水定容至10mL，4000r/min離心15min，雙縮脲法測定上清液蛋白質含量，并同時將樣品溶于0.5mol/L醋酸溶液采用雙縮脲法測定樣品總蛋白含量，用公式（2）計算溶解性[7].

溶解性%=（上清液蛋白質量/總蛋白質量）×100 （2）

1.3.8 吸油性測定

取兩份10mL精煉油，分別加入0.1g ASC和PSC，振蕩器震蕩1min，靜置半小時，于200r/min離心25min，按公式（3）計算吸油性[7].

X=（10.0-v）/m? ?（3）

式中：X為吸油性/（mL/g）;Vf為游離油的體積/mL;m為0.1g.

1.3.9 保水性測定

量取50mL蒸餾水，加入ASC和PSC 0.05g，攪拌，置于1000r/min條件下離心5min，棄分離水，稱量殘留物質量，并置于25℃干燥箱中，每隔20min測一次質量，按公式（4）計算水分殘存率[7]，以其衡量兩者保水性強弱.

Y%=（m-m/m-0.05）×100? （4）

式中：Y表示水分殘存率%;m0表示離心剩余物質量/g;m表示每隔一段時間剩余物質量/g.

2 結果與分析

2.1 不同提取液膠原蛋白得率

在酸性條件下，蛋白質分子之間離子鍵遭到破壞，發(fā)生膠原纖維膨脹、溶解現(xiàn)象，因而可利用酸法提取膠原蛋白;酶法提取是利用蛋白酶使膠原溶解[9].由圖1可得，酶法提取膠原蛋白得率較酸法提取高，且提高近2倍.

2.2 紫外吸收光譜分析

對酸溶性膠原蛋白提取液和酶溶性膠原蛋白提取液在紫外光區(qū)進行全波長掃描測試，得到的紫外掃描曲線如圖2所示，由于膠原蛋白共軛氨基酸含量較少，在280nm波長處無吸收峰，而在225nm左右有最大吸收峰，試驗結果符合膠原蛋白的吸收特征[10]，且雜峰較少，表明提取膠原蛋白純度較高.

2.3 紅外光譜分析

如圖3所示，ASC和PSC產(chǎn)生的吸收峰形狀和位置基本一致，在4000～3000cm-1范圍內，ASC和PSC均有一個較寬的峰，分別在3450cm-1和3440cm-1處，是由酰胺A帶所產(chǎn)生[11];PSC在2000～1000cm-1波數(shù)內出現(xiàn)三個強而窄的吸收峰，其中1640cm-1處吸收峰是由膠原蛋白酰胺I帶產(chǎn)生，在1550cm-1（ASC）和1560cm-1（PSC）處的吸收峰是由膠原蛋白酰胺II帶產(chǎn)生，1390cm-1處為酰胺III帶吸收峰，綜上表明PSC和ASC主體結構均保留比較完整.

2.4 溶解性

溶解度指物質在特定溶劑中溶解的最大限度，其在天然蛋白質提取、分離和純化時起到重要作用，蛋白質變性程度也可通過蛋白質的溶解行為的變化作為評價指標，此外蛋白質在飲料中的應用也與其溶解性能有直接的關系[12].

如圖4所示，隨著pH值的上升，PSC和ASC的溶解性先快速下降又逐漸趨于平緩.pH=4時PSC和ASC的溶解性最好，ASC可達80%，PSC達63%，而pH在7～9時膠原蛋白的溶解性較差，在30%左右.膠原蛋白溶解性隨pH的變化跟其等電點位置有關，當處于等電點，兩性離子達到電荷平衡，溶解度達到最低[13-14]，因此結果表明羅非魚魚皮膠原蛋白等電點位于7附近.

2.5吸油性

圖5可見，ASC和PSC的吸油能力約為30mL/g和49mL/g.PSC的吸油性更佳，可能與胃蛋白酶作用于酶切位點使得較多疏水基團暴露，使得酶溶性膠原蛋白吸油能力增加，且研究表明，蛋白質吸油性跟其結構密切相關[15].

2.6 保水性

保水性指當?shù)鞍踪|受到外力作用時其保持水分的能力，受濃度、離子種類以及環(huán)境等影響[7].ASC和PSC在25℃條件下隨時間改變保水性的變化如圖6所示，水分殘存率隨時間增加逐漸下降，但ASC保水性較PSC下降緩慢，可能由于醋酸和胃蛋白酶對親水基團的作用差異，使得暴露的親水基團不同360min后，ASC和PSC的水殘存率仍然在90%作用，保水性均優(yōu)良.

3 結論與討論

酸法和酶法提取羅非魚魚皮膠原蛋白并比較其理化性質，兩種方法提取得到的膠原蛋白主體結構基本一致，均保留較完整;但從得率、溶解性和吸油性的角度，酶法提取得到的膠原蛋白更優(yōu)，而酸法提取的膠原蛋白保水性較好，因此，醋酸法和胃蛋白酶法提取的膠原蛋白可應用于不同的領域.

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