祝朝霞，李春梅，王丹，劉鵬，賈晨，劉磊

(1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，哈爾濱150066；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱150028；3.北京良潤生物科技有限公司，北京102200)

0 引言

沙門氏菌是一類菌型繁多、對人類和動物有極大危害的革蘭氏陰性腸桿菌[1-2]。沙門氏菌是引起食物中毒和腸道腹瀉的食源性致病菌之一，其引起的食物中毒病例位居首位[3-4]。目前的檢測方法由傳統(tǒng)檢測法發(fā)展到免疫學(xué)、分子生物學(xué)和電化學(xué)等方法，但因上述檢測方法操作繁瑣、成本高，難以滿足短保質(zhì)期乳制品等食品生產(chǎn)后快速出廠致病菌的檢測要求，因此快速檢測測試片成為近年來的研究熱點[5-6]。其原理是顯色培養(yǎng)基是建立在細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)的基礎(chǔ)上，利用微生物特異性酶的特點，在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的顯色底物，使菌落呈現(xiàn)特點的顏色進(jìn)而實現(xiàn)分離和鑒別微生物的目的[7-8]。

快速檢測沙門氏菌的測試片是利用選擇性培養(yǎng)基，冷凝膠和指示劑，根據(jù)酶與底物顯色劑的顯色反應(yīng)，利用預(yù)制技術(shù)把培養(yǎng)系統(tǒng)集成到一個預(yù)制系統(tǒng)，開發(fā)出的一種沙門氏菌測試片產(chǎn)品。本文對選擇性培養(yǎng)基和顯色劑進(jìn)行優(yōu)化。

1 實驗

1.1 材料

標(biāo)準(zhǔn)菌株：鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium），甲型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi A），乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），大腸埃希氏菌（Escherichia coli），肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacteriaceae），陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae），福氏志賀菌（Shigella flexneri），宋氏志賀菌（Shigella sonnei），弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）。

主要試劑：氯化鈉，丙酮酸鈉，碳酸鈣，牛膽鹽，新生霉素，脫氧膽酸鈉，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；營養(yǎng)肉湯（蛋白胨、氯化鈉、牛肉湯），BPW培養(yǎng)基（蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀），XLD培養(yǎng)基（酵母浸粉、L-賴氨酸、乳糖、蔗糖、去氧膽酸鈉、檸檬酸鐵胺、硫代硫酸鈉、氯化鈉、酚紅），BS培養(yǎng)基（蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、煌綠、亞硫酸鈉），均購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯溶液，購于美國Genview公司。

設(shè)備及儀器：MLS-33020CH型高壓蒸汽滅菌鍋（上海鼎謙生物科技有限公司），BT125D型電子分析天平（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司），SPX-250B型恒溫培養(yǎng)箱（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司），SW-CI-2G型生物超凈工作臺（蘇州江東精密儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

將沙門氏菌接種至營養(yǎng)肉湯，36℃150 r/min過夜振蕩培養(yǎng)活化。活化后的沙門氏菌進(jìn)行10倍梯度稀釋，計數(shù)后保存在-4℃冰箱中備用。

1.2.2 促進(jìn)劑優(yōu)化

1.2.2.1 碳酸鈣的單因素實驗

以BPW為沙門氏菌測試片基礎(chǔ)，分別添加的碳酸鈣濃度為1 mg/L，2 mg/L，3 mg/L，4 mg/L，5 mg/L。接種沙門氏菌，做陽性對照，36±1℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)，考察碳酸鈣濃度對沙門氏菌菌落總數(shù)的影響，每個濃度平行測定三次。

1.2.2.2 丙酮酸鈉的單因素實驗

以BPW為沙門氏菌測試片基礎(chǔ)，分別添加的丙酮酸鈉濃度為1 g/L，2 g/L，3 g/L，4 g/L，5 g/L。接種沙門氏菌，做陽性對照，36±1℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)，考察丙酮酸鈉濃度對沙門氏菌菌落總數(shù)的影響，每個濃度平行測定三次。

1.2.2.3 促進(jìn)劑的正交優(yōu)化

參考單因素實驗結(jié)果，以其用量為因素，進(jìn)行2因素2水平的正交實驗，平行測定三次，因素及水平見表1?？疾旄饕蛩貙ι抽T氏菌菌落總數(shù)的影響，確定最優(yōu)促進(jìn)劑組合的濃度。

表1 促進(jìn)劑因素及水平

1.2.3 抑制劑優(yōu)化

1.2.3.1 牛膽鹽的單因素實驗

以BPW為沙門氏菌測試片基礎(chǔ)，分別添加的牛膽鹽濃度為1 g/L，2 g/L，3 g/L，4 g/L，5 g/L。分別接種沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌，36±1℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)，考察牛膽鹽濃度對三種菌株菌落總數(shù)的影響，每個濃度平行測定三次。

1.2.3.2 新生霉素的單因素實驗

以BPW為沙門氏菌測試片基礎(chǔ)，分別添加的新生霉素濃度為0.5 mg/L，1 mg/L，2 mg/L，5 mg/L，10 mg/L。分別接種沙門氏菌、大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌，36±1℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)，考察新生霉素濃度對三種菌株菌落總數(shù)的影響，每個濃度平行測定三次。

1.2.3.3 脫氧膽酸鈉的單因素實驗

以BPW為沙門氏菌測試片基礎(chǔ)，分別添加的脫氧膽酸鈉濃度為0.5 g/L，1 g/L，5 g/L，10 g/L，15 g/L。分別接種沙門氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌，36±1℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)，考察脫氧膽酸鈉濃度對三種標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落總數(shù)的影響，每個濃度平行測定三次。

1.2.3.4 抑制劑的正交優(yōu)化

參考單因素實驗結(jié)果，以其用量為因素，進(jìn)行3因素3水平的正交實驗，平行測定三次，因素及水平見表2?？疾旄饕蛩貙ι抽T氏菌菌落總數(shù)的影響，確定最優(yōu)促進(jìn)劑組合的濃度。

表2 抑制劑因素及水平

1.2.4 顯色底物劑量的確定

根據(jù)計數(shù)結(jié)果選擇稀釋度，快檢培養(yǎng)基稀釋活化后的菌株，分別添加0.05 g/L，0.1 g/L，0.15 g/L，0.2 g/L，0.3 g/L，0.4 g/L的5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯，接種測試片，同時做陽性對照，平行測定三次，36±1℃培養(yǎng)。在24 h內(nèi)觀察測試片的顯色情況，確定培養(yǎng)時間，通過觀察菌落形態(tài)和菌落顏色評定顯色效果，顯色效果用“+”表示。

1.3 特異性驗證

用無菌生理鹽水對活化后的鼠傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、福氏志賀菌、宋氏志賀菌、弗氏檸檬酸桿菌進(jìn)行10倍梯度稀釋，制備成104CFU/mL菌懸液。用接種環(huán)取菌懸液在快速檢測培養(yǎng)基上劃線，于36±1℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。

1.4 食品檢測、驗證試驗

從市場上采集各類乳制品等共計100份。由于國家對預(yù)包裝食品進(jìn)行嚴(yán)格把控，所以需對部分樣品添加沙門氏菌。參照食品微生物學(xué)檢驗國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016沙門氏菌檢驗，對樣品中的沙門氏菌進(jìn)行檢驗，分別在快速檢測培養(yǎng)基（需前増菌）、國標(biāo)BS、XLD培養(yǎng)基平板上進(jìn)行對比分析[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 促進(jìn)劑的實驗結(jié)果與分析

2.1.1 碳酸鈣的單因素分析

白世平等人的專利表明碳酸鈣能顯著促進(jìn)沙門氏菌增長[10]。將單因素實驗中丙酮酸鈉的濃度設(shè)定為1～5 mg/L，其他培養(yǎng)條件不變，改變培養(yǎng)基中碳酸鈣濃度對沙門氏菌生長的影響由圖1可知，隨著碳酸鈣濃度逐漸升高，菌落總數(shù)呈上升趨勢，當(dāng)濃度達(dá)到2 mg/L時，菌落總數(shù)趨于穩(wěn)定。經(jīng)F檢驗和LSD兩兩比較，碳酸鈣濃度在2 mg/L時的菌落總數(shù)與濃度為3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L時的菌落總數(shù)均不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），從經(jīng)濟(jì)成本考慮，將2 mg/L作為正交實驗中碳酸鈣的中間濃度水平。

2.1.2 丙酮酸鈉的單因素分析

圖1 碳酸鈣濃度對菌落總數(shù)的影響

錢紅枚等人的研究表明丙酮酸鈉能顯著促進(jìn)沙門氏菌生長[11]。將單因素實驗中丙酮酸鈉的濃度設(shè)定為1～5 g/L，其他培養(yǎng)條件不變，改變培養(yǎng)基中丙酮酸鈉濃度對沙門氏菌生長的影響由圖2可知，隨著丙酮酸鈉濃度逐漸升高，菌落總數(shù)呈上升趨勢，當(dāng)濃度達(dá)到3 g/L時，菌落總數(shù)趨于穩(wěn)定。沙門氏菌在丙酮酸鈉的濃度3 g/L時生長狀態(tài)較優(yōu)。經(jīng)F檢驗和LSD兩兩比較，丙酮酸鈉濃度在3 g/L時的菌落總數(shù)與濃度為4 g/L、5 g/L時的菌落總數(shù)均不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），從經(jīng)濟(jì)成本考慮，將3 g/L作正交實驗中丙酮酸鈉的中間濃度水平。

圖2 丙酮酸鈉濃度對菌落總數(shù)的影響

2.1.3 促進(jìn)劑正交實驗分析

各促進(jìn)劑對沙門氏菌菌落總數(shù)的影響見表3，2種促進(jìn)劑對菌落總數(shù)的影響順序為：碳酸鈣A＞丙酮酸鈉B。最優(yōu)方案為A1B2，即碳酸鈣1.5 mg/L，丙酮酸鈉3 g/L。

表3 各促進(jìn)劑對沙門氏菌菌落總數(shù)的影響

2.2 抑制劑單因素實驗

2.2.1 牛膽鹽單因素實驗結(jié)果

錢紅枚等人的研究表明牛膽鹽能抑制某些腸道致病菌、革蘭氏陽性菌生長[11]。將單因素實驗中牛膽鹽的濃度設(shè)定為1～5 g/L，其他培養(yǎng)條件不變，改變培養(yǎng)基中牛膽鹽濃度對沙門氏菌生長的影響由圖3可知，沙門氏菌菌落總數(shù)隨牛膽鹽濃度升高而升高，濃度為3 g/L時達(dá)到最高，隨后逐漸下降，金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌的菌落總數(shù)隨牛膽鹽的濃度升高而降低。經(jīng)F檢驗和LSD兩兩比較，牛膽鹽濃度在3 g/L時三種標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落總數(shù)與濃度為4 g/L、5 g/L時的菌落總數(shù)均不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），從經(jīng)濟(jì)成本考慮，3 g/L作為正交實驗中牛膽鹽的中間濃度水平。

圖3 牛膽鹽濃度對菌落總數(shù)的影響

2.2.2 新生霉素單因素實驗結(jié)果

于瑞莉等人的專利表明新生霉素能抑制部分革蘭氏陰性腸桿菌，顯著促進(jìn)沙門氏菌辛酸醋酶的產(chǎn)生[12]。將單因素實驗中新生霉素的濃度設(shè)定為0.5～10 mg/L，其他培養(yǎng)條件不變，改變培養(yǎng)基中新生霉素濃度對沙門氏菌生長的影響由圖4可知，沙門氏菌菌落總數(shù)隨新生霉素濃度升高而升高，濃度為2 g/L時達(dá)到最高，隨后逐漸下降，大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌的菌落總數(shù)隨新生霉素的濃度升高而降低。經(jīng)F檢驗和LSD兩兩比較，新生霉素濃度在2 mg/L時的菌落總數(shù)與濃度為5 mg/L、10 m/L時四種標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落總數(shù)均不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），從經(jīng)濟(jì)成本考慮，2 mg/L作為正交實驗中新生霉素的中間濃度水平。

圖4 新生霉素濃度對菌落總數(shù)的影響

2.2.3 脫氧膽酸鈉單因素實驗結(jié)果

莊嚴(yán)等人的研究表明脫氧膽酸鈉能抑制革蘭氏陽性菌的生長，對沙門氏菌的抑制作用弱[13]。將單因素實驗中脫氧膽酸鈉的濃度設(shè)定為0.5～15 g/L，其他培養(yǎng)條件不變，改變培養(yǎng)基中脫氧膽酸鈉濃度對沙門氏菌生長的影響由圖5可知，沙門氏菌菌落總數(shù)隨脫氧膽酸鈉濃度升高而升高，濃度為5 g/L時達(dá)到最高，隨后逐漸下降，金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌的菌落總數(shù)隨脫氧膽酸鈉的濃度升高而降低。經(jīng)F檢驗和LSD兩兩比較，脫氧膽酸鈉濃度在5 g/L時的菌落總數(shù)與濃度為10 g/L、15 g/L時四種標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落總數(shù)均不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），從經(jīng)濟(jì)成本考慮，5 g/L作為正交實驗中脫氧膽酸鈉的中間濃度水平。

圖5 脫氧膽酸鈉濃度對菌落總數(shù)的影響

2.3 抑制劑的正交實驗與分析

各抑制劑對沙門氏菌菌落總數(shù)的影響見表4，3種選擇劑對菌落總數(shù)的影響順序為：新生霉素D＞脫氧膽酸鈉E＞牛膽鹽C。最優(yōu)方案為C2D2E2，即牛膽鹽3 g/L，新生霉素2 mg/L，脫氧膽酸鈉5 g/L。

表4 各抑制劑對沙門氏菌菌落總數(shù)的影響

2.4 顯色底物及其劑量的確定與分析

據(jù)Manafi等報道，沙門氏菌屬能產(chǎn)生特異性較強(qiáng)的辛酯酶，在培養(yǎng)基中添加辛酯顯色底物5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯，使菌落呈現(xiàn)出藍(lán)綠色[14-15]。

圖6 顯色底物顯色效果圖

分別于18 h、20 h、24 h觀察測試片顯色結(jié)果，18 h即可顯色，培養(yǎng)時間越久顯色效果越深。檢測時間明顯優(yōu)于國標(biāo)法檢測。

表5 不同濃度顯色底物顯色效果

由圖6和表5可知，5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯濃度的改變對沙門氏菌顯色狀況影響極大，當(dāng)5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯的濃度不低于0.2 g/L時培養(yǎng)基顯色效果極佳，從經(jīng)濟(jì)成本考慮，選擇5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯的濃度為0.2 g/L。

2.5 特異性驗證結(jié)果與分析

特異性驗證結(jié)果見表6，在被檢測的11種細(xì)菌中，3株沙門氏菌陽性檢出率為100%，其余8種非目標(biāo)菌均未檢出，說明該快檢培養(yǎng)基具有較好的選擇性和特異性。

表6 特異性驗證結(jié)果

2.6 食品樣品檢測結(jié)果與分析

對采取的80份乳制品和加標(biāo)的20份乳制品進(jìn)行檢測，根據(jù)國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的沙門氏菌最低檢出限來判定所取樣品是否為陽性?？焖贆z測培養(yǎng)基與BS培養(yǎng)基平板、XLD培養(yǎng)基平板對食品中沙門氏菌陽性結(jié)果符合均為19份，陰性結(jié)果符合分別為80份、79份，總符合率分別為99%、98%。經(jīng)配對樣本T檢驗得出，快速檢測培養(yǎng)基與國標(biāo)BS培養(yǎng)基平板的檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（t=0.000，P＞0.05），快檢培養(yǎng)基測試片與國標(biāo)XLD培養(yǎng)基平板的檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（t=0.000，P＞0.05），說明該快檢培養(yǎng)基測試片在乳制品沙門氏菌方面的檢測中具有較高的檢測效率。

3 結(jié)論

本文所選擇的沙門氏菌快速檢測培養(yǎng)基促進(jìn)劑為碳酸鈣、丙酮酸鈉，抑制劑為牛膽鹽、新生霉素、脫氧膽酸鈉，顯色底物為5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯。所優(yōu)化的沙門氏菌快速檢測培養(yǎng)基的成分為：碳酸鈣1.5 mg/L，丙酮酸鈉3 g/L，牛膽鹽3 g/L，新生霉素2 mg/L，脫氧膽酸鈉5 g/L，5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯0.2 g/L，在36±1℃培養(yǎng)18 h即可使菌落呈現(xiàn)出藍(lán)綠色，且效果穩(wěn)定。檢測實際樣品結(jié)果與國標(biāo)法無差異，在檢測時間方面具有極大的優(yōu)勢，僅需一步増菌，大大縮短了檢測時間，可以滿足快速檢測的要求，適合一般實驗室及現(xiàn)場檢測，可以向食品生產(chǎn)廠家進(jìn)行宣傳及推廣。