馬飛　許文超　宿雅彬　王建昌　李濤

摘要 本研究運用分子生物學方法，對進口荷斯坦奶牛遺傳物質(zhì)、進口種牛、國產(chǎn)牛精液等進行BLAD、CVM、DUMPS、FDS4種主要遺傳病篩查，采用的PCR-RFLP方法是對提取產(chǎn)物的致病序列進行PCR擴增，后均采用酶切的方法對標本進行純合子和隱性雜合子的鑒定，本文標本來自進口52份牛精液（美國、加拿大）、國產(chǎn)112份牛精液標本.650份進口種牛血液樣品（澳大利亞、新西蘭、烏拉圭、智利等國家），通過對814份樣品的篩查，共檢出攜帶BLAD隱性有害基因的樣品6份，攜帶CVM隱性有害基因的樣品15份，攜帶DUMPS隱性有害基因的樣品4份，未檢測到攜帶FDS隱性有害基因的樣品?；诖耍覈斜匾M快建立荷斯坦牛隱性遺傳缺陷監(jiān)控體系并進行系譜標注，以逐步降低我國奶牛群體中遺傳缺陷隱性等位基因頻率。

關鍵詞 進境種牛;遺傳缺陷病;檢測方法;應用

中圖分類號 S858.23

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）08-0218-05

1綜述

遺傳缺陷病是動物個體發(fā)生基因突變或染色體畸變導致的遺傳疾病，導致發(fā)育個體出現(xiàn)身體結構上的缺陷或者功能性障礙，從而影響生產(chǎn)性能，具有先天性和家族性的特征。遺傳缺陷病分為單染色體遺傳病、染色體遺傳病和多染色體遺傳病。單基因遺傳病是指一對主基因突變造成的疾病，其遺傳符合孟德爾定律，荷斯坦牛中最常見以常染色體隱性為主如荷斯坦牛脊柱畸形綜合癥（CVM）、荷斯坦牛白細胞粘附缺陷（BLAD）、荷斯坦牛尿氨酸合酶缺陷癥（DUMP），以及新發(fā)現(xiàn)的牛面部畸形綜合癥（FDS）等。

近年來，由于人工授精技術的普及以及奶牛生產(chǎn)力和養(yǎng)殖效益的大幅提高，奶牛遺傳缺陷病危害逐年增加。目前，一些國家每年都會檢測公牛的一些遺傳缺陷，并淘汰攜帶者。2017年我國進口種牛逾10萬頭，進口牛精液及胚胎300萬只，種公牛數(shù)百頭。本研究對部分進口公牛和奶牛的精液及血液標本進行篩查，旨在了解我國部分進口和國內(nèi)公牛及奶牛的遺傳缺陷情況，并希望初步建立一種方便快捷的遺傳缺陷病篩查方法。這樣以來，就可提前把具有及攜帶遺傳缺陷病基因的病牛拒國]之外，對我國畜牧業(yè)穩(wěn)定發(fā)展及保障畜禽衛(wèi)生健康具有重要意義。

1.1CVM疾病簡述

脊柱畸形綜合征（complexvertebralmalformation，CVM），是荷斯坦牛的一種常染色體致死性隱性遺傳病，CVM主要表現(xiàn)為純合子胎兒的早期死亡，純合子胎兒在出生后極少能存活，但是CVM雜合子后代（攜帶者）表現(xiàn)正常，能存活?；疾倥５牟顬樾刈岛皖i椎較正常犢牛短，掌指關節(jié)和跖趾關節(jié)對稱性地收縮和彎曲，體重較同期正常犢牛輕20%左右，另外還常見不同程度的椎骨半側(cè)缺失、脊柱側(cè)凸以及脊柱的骨間連合等（注：在CVM患者中發(fā)現(xiàn)了脊椎沒有損傷的特例）。一些CVM患病胎兒還存在肺部和心臟畸形.CVM嚴重影響奶業(yè)生產(chǎn)。

Agerholm等研究確診CVM為常染色體隱性遺傳病，確定CVM的候選基因是SLC35A3（solutecarrierfamily35，memberA3）基因，本研究根據(jù)CVM發(fā)病的分子機理為CVM患牛的3號染色體（BTA3）上的SLC35A3（BovineSoluteCarrierFamily35Member3）基因的第4外顯子559處發(fā)生G-T突變，導致180處纈氨酸置換為苯丙氨酸，致使異常的核苷酸轉(zhuǎn)運至高爾基體從而使Rsal限制性酶切位點消失的原理，通過PCR-RFLP方法對此標本進行鑒定分析。針對G559T突變位點設計了一對引物，特異性擴增牛SLC35A3基因含有上述點突變的片段，長度為225bp。經(jīng)限制性內(nèi)切酶RsaI酶切后，正常個體產(chǎn)生201bp和24bp的DNA條帶，而攜帶者產(chǎn)生201、24、225bp的DNA條帶，純合隱性個體仍為225bp。

1.2BLAD疾病簡述

荷斯坦牛白細胞粘附缺陷（bovineleukocyteadhesiondeficiency，BLAD）是荷斯坦牛的一種重要的單堿基突變隱性遺傳疾病。在相同的飼養(yǎng)條件下，荷斯坦牛BLAD純合子與正常荷斯坦牛相比，生長明顯緩慢，皮毛無光澤，對于病原微生物尤其是細菌的易感性高，主要特征表現(xiàn)為嚴重的重復細菌感染、缺少化膿、損傷愈合延遲和白細胞增多?？谇粌?nèi)、舌和牙眼出現(xiàn)潰瘍，嚴重時由于牙床及骨翻的炎癥而引起整個下領腫大。咽部出現(xiàn)明顯炎癥，呼吸道和肺部出現(xiàn)炎癥。在胃和腸道出現(xiàn)潰瘍，腎臟炎癥，大多數(shù)淋巴結腫大。骨髓內(nèi)的血細胞，主要是白細胞成熟中性顆粒細胞增多。在毒血癥時，血管內(nèi)的中性顆粒細胞濃度非常高，但在炎癥部位反而很低，導致炎癥長期不愈。

在荷斯坦牛育種中以剔除荷斯坦牛BLAD雜合子為主。BLAD遺傳缺陷病其分子遺傳學機制為牛1號染色體上CD18基因編碼區(qū)發(fā)生A383G突變，導致第128位氨基酸由天門冬氨酸變?yōu)楦拾彼?。本研究根?jù)BLAD患病牛CD18基因編碼區(qū)序列第383位點的A/G突變，從而使TaqI限制性酶切位點消失的原理，通過PCR-RFLP方法對標本進行鑒定分析，針對A383G突變位點設計了一對引物，特異性擴增奶牛CD18基因含有上述點突變的片段，長度為343bp。經(jīng)限制性內(nèi)切酶TaqI酶切后，正常個體產(chǎn)生191bp和152bp的DNA條帶，而攜帶者產(chǎn)生191、152343bp的DNA條帶，純合隱性個體仍為324bp。

1.3DUMPS疾病簡述

尿苷酸合酶缺乏癥（deficiencyofuridinemonophophatesynthase，DUMPS）是荷斯坦牛胚胎早期死亡的一種常染色體單基因隱性遺傳缺陷病，最早于1987年在美國發(fā)現(xiàn)。臨床癥狀為血液中瓜氨酸含量升高，尿素循環(huán)受阻引起高氨血癥，從而導致犢牛在出生1周內(nèi)死亡，或者母牛懷孕40d左右時流產(chǎn).DUMPS的遺傳學基礎是奶牛1號染色體（BTA1）上的UMPS基因C-末端密碼子405處存在著一個C-T點突變，可導致原來編碼精氨酸的CGA轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a終止密碼子的TGA，導致基因編碼產(chǎn)物催化亞基C-末端缺失76個氨基酸。由于這種蛋白質(zhì)的酶催化功能喪失，造成其作用底物乳清酸的大量積累。

本研究根據(jù)該病發(fā)生的分子機理通過PCR-RFLP的檢測方法對大量標本進行檢測分析，其原理是：針對C405T突變位點設計了一對引物，特異性擴增牛UMPS基因含有上述點突變的片段，長度為108bp，因酶切片段較小且較接近，為觀察酶切反應是否充分，引入第二Aval酶切位點。經(jīng)限制性內(nèi)切酶Aval酶切后，正常個體產(chǎn)生53、36、19bp的DNA條帶，而攜帶者產(chǎn)生89、53、36、19bp的DNA條帶，純合隱性個體產(chǎn)生89bp和19bp條帶。因19bp條帶太小，通常觀察不到。

1.4FDS疾病簡述

牛面部畸形綜合癥（FDS）是2017年被文獻報道出來的新發(fā)現(xiàn)的遺傳性疾病，其發(fā)病機理是位于26號染色體上編碼FGFR2基因6號外顯子第927位的堿基由G變?yōu)門（G.927T），與之相應的高度保守的氨基酸由色氨酸變?yōu)榘腚装彼幔═rp309Cys），致使成千維細胞受體因子發(fā)生改變而引起臨床發(fā)病。其臨床表現(xiàn)為病畜面部嚴重發(fā)育不良、完全眼下垂、嚴重影響生存率。目前，國內(nèi)和國外對此病研究均很少，本課題挑選該病提取標本基因組，用包含突變位點的引物特異性擴增牛FGFR2基因含有上述點突變的片段，長度為202bp。用基因測序的方法對進口及國內(nèi)牛標本突變情況進行檢測，以初步了解該病的遺傳攜帶情況。

2牛遺傳疾病分子生物學檢測方法

2.1試驗材料

2.1.1樣本來源。本文中標本來自于進口52份牛精液（美國、加拿大）、國產(chǎn)112份牛精液標本650份進口種牛血液樣品（澳大利亞新西蘭、烏拉圭、智利）。

2.1.2主要儀器設備。BeckmanCoulter離心機（型號：Micro-fuge20R）、Eppendorf梯度PCR儀（型號：5331）、Bio-Rad伯樂凝膠成像系統(tǒng)SYSTEMGelDocXR+（型號：1708195）、Bio-Rad伯樂穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及水平電泳槽、紫外分光光度計、水浴恒溫振蕩器、移液器（2、10、20、100、200、1000μL）、Millipore超純水器。

2.2試驗試劑

血液組織DNA提取試劑盒（貨號：69504，Qiagen）、膠回收試劑盒（貨號：28706，Qiagen）、PCR試劑盒（貨號：M7123Promega）限制性內(nèi)切酶TaqI（貨號：1189A，Takara）、DL500Marker（貨號：3590QTakara）、瓊脂糖（北京化學試劑公司）、無水乙醇（北京化學試劑公司）、異丙醇（北京化學試劑公司）。

2.3引物合成

弓物均由上海生工生物技術服務有限公司合成，如表1所示。

2.4試驗方法

2.4.1樣品制備。收集牛精液液氮保存;收集牛未抗凝血液的血細胞成份于-20C條件下保存。

牛精液及血液中DNA提取：取500μL牛精液（或100μL血液），1500r/min離心5min，棄上清，加20μL蛋白酶K，混勻。加200μLBufferAL充分混勻，56C孵育10min。加200μL乙醇充分混勻，移入洗脫柱，8000r/min離心1min。棄廢液，加入500μLAW1，8000r/min離心1min。棄廢液，加人500μLAW2，13000r/min離心3min，棄廢液及廢管。更換1.5mL離心管，加入50μL去離子水8000r/min離心1min，再加入50μL去離子水洗脫2次，共100μLDNA標本。

2.4.2引物配置。按說明書要求加入雙蒸水至100pmol/μL的儲存液，再兩次10倍稀釋至10pmol/μL的即用引物備用。2.4.3PCR反應體系及條件。①BLAD、CVM、DUMPS、FDSPCR反應體系：20μLMasterMix、2μLPrimerF（l0pmol/uL）、2μLPrimerR（10pmol/μL）、16μLDNA，總體積40μL。②BLAD、CVM、DUMPSPCR反應條件為959C預變性2min，959C變性30s，59C退火30s，72C延伸1min，反應30個循環(huán)。循環(huán)結束后，95C延伸5min，4C保存。③FDSPCR反應條件為95C預變性2min，959C變性30s，57C退火30s，72C延伸1min，反應30個循環(huán)。循環(huán)結束后，72C延伸5min，4C保存。

2.4.4瓊脂糖制作及制膠。①瓊脂糖凝膠制作。取1g瓊脂糖溶于100mLTAE中，在微波爐加熱至瓊脂糖全部熔化，使溶液冷卻至60C，加入10mg/mLEB2μL.②灌膠。用橡皮膏將電泳內(nèi)槽的兩端邊緣封好，不留縫隙。將內(nèi)槽放置于水平臺面，并插好梳子。待瓊脂糖凝膠液冷卻至60C左右，將其緩慢倒入內(nèi)槽至厚度0.5cm左右，不要形成氣泡，特別是梳子下，如有氣泡可用牙簽挑破。待膠凝固后，拔出梳子，撕去橡皮膏或透明膠帶，將帶凝膠的內(nèi)槽放人電泳槽中，靠近負極端點樣。加入1xTAE緩沖液至電泳槽，緩沖液剛沒過凝膠表面即可。

2.4.5加樣。直接取40μLPCR產(chǎn)物將其分別加入凝膠的點樣孔并記錄點樣順序。

2.4.6電泳。接通電源槽與電泳儀的電源，檢查正負極。DNA的遷移率與電壓成正比，電壓150V電壓，當溴酚藍染料移動至凝膠前沿1.5cm處，切斷電源，停止電泳。取出內(nèi)槽，推出凝膠，將其放人凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察結果，DNA存在處應顯出明亮條帶，觀察分析、拍照、切膠保存。

2.5PCR產(chǎn)物膠純化

將300μLQG液體加入裝有膠的EP管中，放入50C水浴鍋中孵育10min，每3min上下混勻1次。加入350μL異丙醇，上下充分混勻。將約750μL混合液移人純化柱，13000r/min離心1min，棄廢液。加500μLQC至純化柱，13000r/min離心1min，棄廢液。加入750μLPE至純化柱，13000r/min離心1min，棄廢液。將純化柱放人新的回收座中，13000r/min離心1min，棄廢液及回收座。

將純化柱移人1.5mLEP上，加入15μL雙蒸水，孵育1min，13000r/min離心2min。棄純化柱，將EP管收集的產(chǎn)物放-20C保存供酶切及測序。

2.6BLAD膠純化產(chǎn)物酶切體

BLAD酶酶切體系及條件：0.5μLTaqI酶、1.0μL1%BSA、1.0μL10xTaqIbuffer、7.5μLDNA、10.0μL總體積，酶切溫度及時間：65C過夜.CVM酶切體系及條件：0.5μLAfaI酶、1.0μL1%BSA、1.0μL10xTaqIbuffer、7.5μLDNA、10.0μL總體積，酶切溫度及時間：37C過夜。DUMPS酶切體系及條件：0.5μLAval酶、1.0μL1%BSA、1.0μL10xTaqIbuffer、7.5μLDNA、10.0μL總體積，酶切溫度及時間：30C過夜。

3結果與分析

3.1牛精液及血液基因組DNA提取結果

取1μL基因組DNA放人紫外分光光度計中讀值，檢測牛精液及血液的濃度及純度。

3.1.1BLAD目的基因PCR結果。由圖1可知，試驗樣本經(jīng)擴增得到一條DNA片段，長度為324bp，與試驗預期結果吻合，可進行RFLP分析。

3.1.2酶切結果，如圖2可知，試驗樣本PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)TaqI酶切后產(chǎn)生AB基因型和AA基因型2種不同分型。其中，AB基因型（即隱形攜帶者）：324、191、152bp，無純合隱性個體;AA基因型（即純合子）：191bp和152bp2條帶，屬正常個體。

3.2CVM牛精液及血液基因組DNA提取結果

CVM牛精液及血液基因組DNA提取結果如圖3所示。1～4號為牛精液基因組DNA提取結果，5～9號為血液基因組DNA提取結果。

3.2.1目的基因PCR結果。由圖4可知，試驗樣本經(jīng)擴增得到一條DNA片段，長度為225bp，與試驗預期結果相吻合，可進行RFLP分析。

3.2.2膠純化產(chǎn)物酶切結果。如圖5可知，試驗樣本PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)TaqI酶切后產(chǎn)生AB基因型和AA基因型2種不同分型。其中，AB基因型（即隱形攜帶者）：201、24、225bp，無純合隱性個體;AA基因型（即純合子）：201bp和24bp2條帶，屬正常個體。

3.3DUMPS牛精液及血液基因組DNA提取結果

本試驗所提取的牛精液基因組DNA條帶單一、清晰，但血液標本提取DNA含量有差別，凍存時間長的標本，提取效率越低，提取DNA經(jīng)紫外分光光度計檢測基因組濃度后，于-20C凍存待用。選提取質(zhì)量高的標本左基因組DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖6。

3.3.1目的基因PCR結果。由圖7可知，試驗樣本經(jīng)擴增得到一條長度為108bp的DNA片段，與試驗預期結果相吻合，可以進行RFLP分析。

3.3.2酶切。如圖8可知，試驗樣本PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)AvaI酶切后產(chǎn)生2種不同分型，AA基因型（即純合子）：53bp和36bp2條帶，屬正常個體;AB基因型（即隱形攜帶者）：89、53、36bp，無純合隱性個體。因19bp條帶太小，通常觀察不到。3.4FDS牛精液及血液基因組DNA提取結果

本試驗所提取的牛精液基因組DNA條帶單一、清晰，但血液標本提取DNA含量有差別，凍存時間長的標本，提取效率越低，提取DNA經(jīng)紫外分光光度計檢測基因組濃度后，于-20C凍存待用。選提取質(zhì)量高的標本左基因組DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖9。

3.4.1目的基因PCR結果。由圖10可知，試驗樣本經(jīng)擴增得到一條長度為202bp的DNA片段，與試驗預期結果相吻合，可以進行RFLP分析。

3.4.2測序結果。圖11為FGFR2目的基因測序結果，從結果上看927位的堿基由G未變?yōu)門，未發(fā)現(xiàn)突變位點。圖12、13分別為FGFR2基因NCBI基因比對結果、FGFR2基因NCBI氨基酸序列比對。

4結論與討論

本試驗通過對進口52份牛精液、國產(chǎn)112份牛精液標本、進口650份牛血液標本共計814份綜合研究，結果如表4所示。本研究利用PCR-RFLP的方法對進口及國產(chǎn)共814份標本進行BLAD遺傳缺陷病檢測分析，發(fā)現(xiàn)進口種公牛及國內(nèi)種公牛無BLAD遺傳病基因，進口650份奶牛中共發(fā)現(xiàn)6頭BLAD隱性基因攜帶者，攜帶率占總共標本數(shù)的1.02%，低于部分文獻報道的地區(qū)攜帶率2%～20%。而且沒有發(fā)現(xiàn)BLAD純合個體，即BLAD感染者，因為這樣的個體在出生后不久便死亡。該研究的目的就是篩查BLAD攜帶者，即AB基因型個體，及時淘汰BLAD攜帶者，掌握BLAD遺傳缺陷在奶牛群中分布情況。

在對CVM的篩查中，進口種公牛精液中CVM攜帶率為零，說明目前國外已重視且做到了對種公牛的CVM遺傳病的有效篩選，這有助于減少CVM在我國荷斯坦牛群中的擴散。國產(chǎn)牛精液檢測出4例陽性，說明但隨著CVM檢測方法的越來成熟和完善，依然有必要對國內(nèi)種公牛建立一種長期有效的檢測機制，一旦發(fā)現(xiàn)，立即處理，防止牛群生產(chǎn)性能及繁殖性能下降;同時，國內(nèi)畜牧場也應進行CVM的基因檢測，避免近交繁殖加大致死率。雖然進口荷斯坦奶?；駽VM攜帶率低于報道水平（11例，1.9%），但伴隨著我國對進口荷斯坦活牛需求的激增，有必要對進口牛的譜系及遺傳病進行篩查，并建立一定范圍的信息共享機制，選擇種群優(yōu)秀的個體進行擴種繁育。

在對DUMPS遺傳缺陷病篩查中，共發(fā)現(xiàn)4頭DUMPS隱性基因攜帶者，發(fā)生率為0.5%，雖然發(fā)生率不高，但如果近交率較大時，將嚴重影響牛群的繁殖性能。因此，還是有必要對進口牛精液及種牛的譜系進行篩查，防止牛群生產(chǎn)性能及繁殖性能下降;同時，國內(nèi)畜牧場也應進行DUMPS的基因檢測，避免近交繁殖加大致死率。在進口及國產(chǎn)牛精液的譜系檢測中，可建立一定范圍的信息共享機制，選擇種群優(yōu)秀的個體進行擴種繁育。

本次研究未發(fā)現(xiàn)有FDS隱形基因攜帶者，但FDS致死率較大，但如果近交率較大時，將嚴重影響牛群的繁殖性能。因此，有必要對進口牛精液及種牛的譜系進行篩查，防止牛群生產(chǎn)性能及繁殖性能下降。

5展望

PCR-RFLP均可適合于以上3種疾病的常規(guī)檢測篩選，標本可選擇精液或血液，該方法簡單快捷、準確性高、成本低廉，適合對牛進行大規(guī)模檢測。對814份樣品的檢測結果為：6頭荷斯坦牛為BLAD攜帶者，攜帶率為0.8%;15頭荷斯坦牛為CVM攜帶者，攜帶率為2.0%：4頭牛為DUMPS攜帶者，攜帶率為0.5%，說明進口奶牛和國內(nèi)牛隱性遺傳疾病雖然攜帶率低于報道，但還有一定比例。對進口32份牛精液的檢測結果為均無攜帶率，說明國外畜牧業(yè)大國對種公牛遺傳疾病檢測還是做到了有意義的篩查。

本研究同時用測序的方法對2017年新報道的遺傳疾病牛面部綜合癥（FDS）進行篩選，對以上標本均為檢測出陽性。說明FDS的攜帶率比較低，可不必要對牛進行大規(guī)模檢測，但對種公牛的篩選還是有長遠意義。

優(yōu)秀種公牛在荷斯坦牛育種過程中被高強度使用，當優(yōu)秀種公牛攜帶隱性遺傳疾病時，隱性遺傳疾病很易被迅速傳播。目前，我國有種公牛超過2000頭，但對遺傳疾病的攜帶率情況不清楚。因此，應對我國荷斯坦種公牛盡快進行遺傳疾病的檢測。由于試驗抽取樣本有限只能對我國荷斯坦牛隱性遺傳疾病攜帶情況進行初步調(diào)查，還應對我國荷斯坦牛隱性遺傳疾病攜帶情況進行大規(guī)模的抽查。隱性遺傳疾病的剔除是一項長期任務，各職能部門應共同努力，加強對進口奶牛、精液及胚胎的檢驗，同時逐步淘汰現(xiàn)已檢測出的攜帶隱性遺傳疾病的荷斯坦奶牛。

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