孫景武 劉志春 黨存曙 劉 彬 邢恩濤

微小RNA是1類長度為22nt大小的小分子非編碼RNA，其主要是通過與靶基因的mRNA 3'端完全或不完全互補結合而調(diào)控基因的表達，進而對細胞的增殖、分化以及凋亡產(chǎn)生影響[1-2]。miR-22是1種較常見的致癌miRNA，其在細胞內(nèi)的表達會影響多種腫瘤細胞的增殖、凋亡以及侵襲能力[3-4]。

BBC-3基因即p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53 up-regulated mod-ulator of apoptosis，PUMA)，是1種促凋亡基因[5]，因p53因子可以迅速誘導其產(chǎn)生強大的促凋亡作用而得名。BBC-3作為p53的下游靶基因，在p53依賴和非依賴途徑凋亡過程中均發(fā)揮重要的作用。有研究表明，BBC-3與肝癌、直腸癌、口腔癌以及乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系[6-9]。

前期利用生物信息學和熒光素酶報告研究表明，miR-222可以與3'UTR基因位點直接結合而共同調(diào)節(jié)BBC-3基因的表達，而促進細胞發(fā)生凋亡[10]。Zhang等[11]的研究報告表明，miR-222聯(lián)合基因轉染乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤以及肺癌后BBC-3基因的表達升高，促進腫瘤細胞凋亡。本研究通過miR-222轉染進入HepG細胞后，BBC-3基因表達水平的變化，并檢測HepG細胞的增殖及凋亡能力，從而為肝癌基因新的治療方式提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

miR-222與miR-222 inhibitor均由上海生物工程技術有限公司合成；HepG2肝癌細胞系購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶均購自Sigma公司：LipofectamineTMRNAiMAX轉染試劑與Trizol均購自美國Invitrogen公司；細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Western-blot電泳液和轉膜液、MTT均購自寶生物工程(大連)有限公司；BBC-3抗體、抗兔IgG二抗均購自艾美捷科技有限公司；FITC和PI的細胞凋亡試劑盒購自Thermo Fisher公司。

1.2 合成的引物序列

miR-222引物序列：F：5'-ACACTCCAGCTGGGAGCTACATCTGGCTACTG-3'，R：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；內(nèi)參U6引物序列：F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；BBC-3引物序列：F： 5'-CAGGAAAGGCTGTTGTGCTG-3'，R：5-AGTGGTCACGTTTGGCTCAT-3'；內(nèi)參片段18S引物序列為：F：5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3'，R：5 '-GCGGCAATACGAATGCCCC-3'。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉染

HepG2細胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每24 h換液1次。細胞生長鋪滿瓶底約80%時，加入0.25%胰蛋白酶和0.05%EDTA進行消化。取對數(shù)生長期的細胞，以每孔1×105個的密度接種于6孔板上，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞生長至60%～80%時，吸去完全培養(yǎng)基，用PBS重新2遍，在每孔加入1 ml無抗生素和血清的opti-MEM培養(yǎng)基。吸取10 μl 20 μmol/l的miR-222和miR-222 inhibitor溶解于opti-MEM培養(yǎng)基中，混勻靜置；將5 μl LipfectamineTM RNAiMAX加入500 μl opti-MEM培養(yǎng)基中，混勻靜置。5 min后將上述兩種溶液混合，靜置20 min，分別加入各孔中，放入CO2培養(yǎng)箱中，4～6 h后，加入轉染培養(yǎng)基，每孔加入2 ml含血清的完全培養(yǎng)基。

1.4 RT-PCR檢測細胞中基因表達

轉染24 h后收集培養(yǎng)的細胞，加入Trizol試劑并提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書合成cDNA。miR-222反應體系為：cDNA 5.0 μl；上游引物0.5 μl；下游引物0.5 μl；2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl；加超純水Total 20 μl。

反應條件：95 ℃變性5 min，95 ℃ 45 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸32 s，40個循環(huán)，72 ℃ 10 min。BBC-3反應體系及反應條件同miR-222。

1.5 Western blot檢測細胞BBC-3蛋白的表達

轉染48 h后，分別提取三組細胞的總蛋白，測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE后轉移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入稀釋好的BBC-3待檢蛋白和內(nèi)參GAPDH一抗，4 ℃過夜，TBST洗滌3次，每次5 min，加入二抗在室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min，ECL試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，表達強度以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比表示。

1.6 MTT法檢測細胞增殖

取處于對數(shù)生長期的細胞，以5×103個/孔接種在96孔板上，三組均設置3個復孔?？蛰d體對照組用含10%FBS的RPMI 1640溶液進行培養(yǎng)，轉染組分別把miR-222與miR-222 inhibitor轉入細胞內(nèi)，操作同1.3，在轉染后的24、48、72 h三組細胞均加入5 mg/ml的MTT溶液，37 ℃ CO2放置4 h，吸去上清液，每孔加入100 μl DMSO溶液，震蕩溶解紫色晶體，在490 nm波長的酶標儀測定吸光度值，檢測三組細胞的生殖情況。

1.7 流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡率

轉染48h后，每組收集1～5×105個細胞，PBS清洗并用70%乙醇固定，過夜，離心收集細胞，PBS洗滌1次，加入500 μl的50 μg/ml的PI、0.2%Triton X-100的PBS以及100 μg/ml 的RNase A，4 ℃避光孵育30 min，利用流式細胞儀檢測各組細胞周期；按上述同樣方法收集洗滌的細胞，無需乙醇進行固定，加入AnnexinV-FITC，室溫避光孵育15 min，以1 500 r/min離心5 min，去除上清，用預冷的緩沖液將細胞重懸，加入PI，利用流式細胞儀測定各組細胞凋亡率。

1.8 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，兩組間率的比較采用四格表資料的χ2檢驗結果，P<0.05認為有差異統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 熒光倒置顯微鏡下觀察轉染效率

空載體轉染組、miR-222轉染組和miR-222 inhibitor轉染組轉染24 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察各組細胞中紅色熒光，miR-222轉染組和miR-222 inhibitor轉染組的均成功進行轉染，而空白對照組熒光較少。

2.2 轉染后miR-222的表達

轉染48 h后，RT-PCR檢測空載體、miR-222 inhibitor和miR-222轉染組中miR-222 RNA相對樣品初始模板量的表達水平分別為(460.09±45.77)、(429.34±36.78)和(1.00±0.08)，miR-222轉染組細胞miR-222表達明顯下調(diào)，與空載體和miR-222 inhibitor轉染組相比具有差異統(tǒng)計學意義(P<0.01)：而miR-222 inhibitor轉染組與空白對照組相比，miR-222表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測轉染后miR-222的表達情況

2.3 轉染后BBC-3蛋白的表達水平

Western blot檢測結果表明，miR-222轉染組細胞BBC-3蛋白的表達水平與空載體轉染組和miR-222 inhibitor轉染組相比表達顯著增加。利用軟件AlphaView計算空載體轉染組、miR-222 inhibitor轉染組、miR-222轉染組的BBC-3蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白的灰度值之比，分別為(1.29±0.13)、(1.32±0.09)和(1.85±0.15)，miR-222轉染組與空載體和miR-222 inhibitor轉染組轉染相比BBC-3基因表達明顯增加，具有差異統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明miR-222基因轉染上調(diào)BBC-3基因表達，見圖2和圖3。

圖2 轉染后BBC-3蛋白的表達情況

圖3 不同轉染組BBC-3蛋白與內(nèi)參灰度值之比

2.4 轉染對肝癌HepG2細胞增殖的影響

MTT法檢測細胞增殖結果表明，24 h、48 h、72 h時miR-222轉染組吸光度值均小于空載體轉染組和miR-222 inhibitor轉染組，miR-222轉染組細胞增殖能力明顯低于空載體轉染組和miR-222 inhibitor轉染組(P<0.05)，表明下調(diào)miRNA-222水平可抑制肝癌HepG2細胞增殖，見表1。

2.5 轉染后細胞凋亡率的變化

三組細胞的凋亡率分別為2.65%、2.72%和13.58%，miR-222轉染組與空載體轉染組和miR-222 inhibitor轉染組相比較細胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討論

BBC-3是新發(fā)現(xiàn)的具有強大促凋亡作用的Bcl-2蛋白家族中的一員，作為p53的靶基因，是p53誘導凋亡途徑中的關鍵介導者。研究結果表明，無論是由射線、缺氧、藥物、DNA損傷等引起的內(nèi)源性p53表達上調(diào)還是p53外源性轉染，其引發(fā)的促細胞凋亡作用均是通過上調(diào)BBC-3基因表達介導的，BBC-3突變或缺失可導致細胞凋亡率降低[12-13]，說明BBC-3是凋亡通路的關鍵基因。近年來相繼有學者研究發(fā)現(xiàn)，BBC-3在許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療過程中均有強大的促凋亡作用。腫瘤是異?；虮磉_的結果，miRNA表型實驗表明許多miRNAs在多種腫瘤中異常表達，主要通過靶分子識別、癌基因或抑癌基因、突變或含有miRNAs染色體片段缺失3種機制參與癌癥發(fā)生。特定的miRNAs表達改變可啟動和促進腫瘤發(fā)生，部分組織中miRNAs可能扮演著癌基因或者抑癌基因的角色[14-16]。MiR-222是常見的致癌miRNA之一，其表達上調(diào)與多種腫瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡能力有關。有學者研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞生長因子受體可轉錄活化c-Jun，從而上調(diào)miR-221/222表達，上調(diào)的miR-221/222作用于PTEN和TIMP3，拮抗TNF相關凋亡誘導配體(TRAIL)引起的凋亡.增強肝癌細胞的惡性生物學特性[17]。Pineau等[18]在對人體肝癌組織及肝癌細胞的研究中進一步證實了上述觀點，此外還發(fā)現(xiàn)miR-221/222可以通過下調(diào)p27Kipl表達增強肝癌細胞的增殖能力。

表1 MTT檢測不同轉染時間細胞增殖情況

注：miR-222轉染組與空載體轉染組比較：*為P<0.05；miR-222轉染組與miR-222 inhibitor轉染組比較：△為P<0.05。

利用生物信息學軟件分析肝癌組織中與BBC-3基因密切相關的miRNAs時發(fā)現(xiàn)，sIANAmT、miRanda、miRwalk、RNAhybrid、PITA、Targetscan等八大靶基因預測數(shù)據(jù)庫均顯示miR-222與BBC-3基因高度相關。肝癌中有關miR-222與BBC-3的關系尚無明確報道.但其在某些腫瘤中已有相關研究。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中miR-221/222含量降低可誘導BBC-3基因表達，促進細胞凋亡，顯著抑制異種移植瘤的生長，表明miR-221/222與BBC-3間存在相反關系，miR-221/222通過靶向調(diào)節(jié)BBC-3表達直接促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡，可作為潛在的治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靶點。在對人類上皮癌細胞的研究中進一步發(fā)現(xiàn)，miR-221/222含量降低可抑制乳腺癌、肺癌等上皮癌細胞增殖.誘導線粒體介導的凋亡。

近年來，效果還有一定差距，可能與miR-222對肝癌細胞抑制作用的具體機制及其有其他作用靶點等有關，有待進一步研究。隨著研究的不斷深入。miR-222基因轉染靶向調(diào)控BBC-3基因表達促進細胞凋亡有望為臨床治療肝癌提供實驗依據(jù)。在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用受到越來越多的關注，但其在口腔癌中的研究卻明顯滯后，miR-222靶向調(diào)節(jié)BBC-3基因表達促進細胞凋亡的具體機制還有待證實。本研究通過miR-222基因轉染抑制細胞內(nèi)miR-222表達，敲低內(nèi)源性miR-222表達量。RT-PCR結果表明，下調(diào)miR-222可誘導促凋亡基因BBC-3表達增加，兩者間存在反向關系，Western blot在蛋白水平上進一步證實了該觀點。MTT細胞增殖實驗結果顯示，miR-222表達量降低，HepG2細胞增殖速度明顯下降，在肝癌中miR-222發(fā)揮著促癌作用。通過流式細胞儀分析細胞周期和凋亡率得知，miR-222轉染組較其他兩組而言G1期細胞數(shù)明顯增多，細胞凋亡率顯著增高，證明miR-222表達降低可影響HepG2細胞周期，促進細胞凋亡，進而發(fā)揮抗癌作用。結果與Zhang等在人類上皮細胞癌中的研究結果相吻合。但該實驗中，實驗組細胞凋亡率為13.58%，雖然較對照組細胞凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義，但是距離腫瘤的理想治療效果還有一定差距，可能與miR-222對肝癌細胞抑制作用的具體機制及其有其他作用靶點等有關，有待進一步研究。隨著研究的不斷深入。miR-222基因轉染靶向調(diào)控BBC-3基因表達促進細胞凋亡有望為臨床治療肝癌提供實驗依據(jù)。