余艷芳，王曉，劉厚紅，郭建峰

兩種測(cè)定信陽茶葉中咖啡堿含量的方法比較

余艷芳，王曉，劉厚紅，郭建峰

（信陽市文新茶葉有限責(zé)任公司，河南信陽 464000）

茶咖啡堿測(cè)定GB/T 8312-2013給出了紫外分光光度法和高效液相色譜法兩種檢測(cè)方法，本研究采用以上兩種方法分別測(cè)定了不同經(jīng)歷貯存期的信陽毛尖茶和信陽紅茶的咖啡堿含量。結(jié)果顯示，高效液相色譜法相對(duì)于紫外分光光度法測(cè)得的咖啡堿含量下降了近16%，且信陽毛尖茶和信陽紅茶下降比例相當(dāng)。同時(shí)，由于生產(chǎn)工藝不同，信陽紅茶中咖啡堿含量總高于信陽毛尖茶。紫外分光光度法測(cè)得的咖啡堿含量偏高，因?yàn)榘伺c其結(jié)構(gòu)類似的其它嘌呤堿類物質(zhì)。另外，若采用紫外分光光度法完全依照國標(biāo)測(cè)得樣品的吸光度大于0.7，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，須將第一步反應(yīng)試液用量減半。

紫外分光光度法；高效液相色譜法；咖啡堿；信陽毛尖茶；信陽紅茶

咖啡堿又名咖啡因，是茶葉主要功能成分之一，具有提神益思、緩解疲勞、強(qiáng)心、利尿的作用，它可溶于水，是形成茶湯滋味的重要物質(zhì)。純咖啡堿是白色的，強(qiáng)烈苦味的粉狀物，茶葉中咖啡堿的特點(diǎn)是苦而不回甘。茶湯中咖啡堿能與兒茶素、茶黃素形成絡(luò)合物，從而提供了具有一定刺激性而又較為協(xié)調(diào)的爽口感?？Х葔A含量是目前許多國內(nèi)、國際貿(mào)易對(duì)茶葉質(zhì)量評(píng)價(jià)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，所以對(duì)茶葉中含有的咖啡堿進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定是非常必要的。以往咖啡堿測(cè)定主要采用重鉻酸鉀滴定法、薄層色譜法、近紅外光譜法、分光光度法、液相色譜法、

1 材料

茶葉樣品

毛細(xì)管電泳茶樣均來自信陽市文新茶葉有限責(zé)任公司，信陽毛尖選擇2015至2018年的A100綠法、質(zhì)譜法等[1]。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8312-2013采用的是紫外分光光度法或高效液相色譜法[2]。由于兩種方法依據(jù)的原理不完全一致，在測(cè)定咖啡堿含量時(shí)可能有所差異，因此本研究通過實(shí)測(cè)信陽毛尖和信陽紅中咖啡堿含量，進(jìn)而比較兩種方法測(cè)定結(jié)果的一致性。茶，共4個(gè)樣品；信陽紅選擇2015至2018年的H100紅茶，共4個(gè)樣品。

茶樣一直貯存于溫度0~5℃的保鮮庫中，2015~2017年的茶樣為保鮮庫中的往年留樣。

儀器

高效液相色譜儀（LC-2010A HT島津），雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），分析天平（沈陽神宇龍騰天平有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠），循環(huán)水式真空泵（上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司），普力菲爾超純水機(jī)（上海富詩特儀器設(shè)備有限公司），微型植物試料粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

試劑

咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%，上海源葉生物科技有限公司），甲醇（GR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），氧化鎂（重質(zhì)AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），堿式乙酸鉛（AR，上海山浦化工有限公司），濃鹽酸（AR，西隴科學(xué)股份有限公司），濃硫酸（AR，開封市芳晶化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

參照GB/T 8312-2013茶咖啡堿測(cè)定，第一法高效液相色譜法和第二法紫外分光光度法。

2.1 高效液相色譜法

咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)液、分析原料的制備、測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和結(jié)果計(jì)算方法完全依據(jù)GB/T 8312-2013“3.1原理~3.5結(jié)果計(jì)算”進(jìn)行。其中，高效液相色譜儀配備紫外檢測(cè)器，采用C18（ODS柱），檢測(cè)波長280nm；流動(dòng)相為V甲醇:V水=3:7的混合液，過0.45μm膜，超聲波脫氣后使用；流速1.0ml/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量10μL。

2.2 紫外分光光度法

試劑和溶液配制、試液制備、咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作完全依照GB/T 8312-2013執(zhí)行。試液測(cè)定相比國標(biāo)有所改動(dòng)，操作如下：用移液管準(zhǔn)確吸取5ml試液至100ml容量瓶中，加入4ml 0.01mol/l鹽酸和1ml堿式乙酸鉛溶液，用水定容至刻度，混勻，靜置澄清過濾。準(zhǔn)確吸取濾液25ml，注入50ml容量瓶中，加入0.1ml 4.5mol/l硫酸溶液，加水稀釋至刻度，混勻，靜置澄清過濾。用10mm石英比色杯，在波長274nm處以試劑空白溶液作參比，測(cè)定吸光度（A）。

咖啡堿含量計(jì)算公式也根據(jù)試液實(shí)際用量相應(yīng)調(diào)整。

3 結(jié)果與分析

3.1 GB/T 8312-2013標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

3.2 不同測(cè)定方法對(duì)信陽毛尖和信陽紅茶中咖啡堿含量的影響

表1 HPLC和UV法測(cè)得供試茶樣中咖啡堿含量

注：A100為同等級(jí)的信陽毛尖、H100為同等級(jí)的信陽紅。

3.3 信陽毛尖和信陽紅茶中咖啡堿含量比較

圖6 咖啡堿“信陽毛尖茶”試樣特征譜圖

圖7 咖啡堿“信陽紅茶”試樣特征譜圖

3.5 結(jié)果分析

采用GB/T 8312-2013中的兩種方法分別測(cè)定相同級(jí)別不同經(jīng)歷貯存期的信陽毛尖和信陽紅茶中咖啡堿含量。由表1可知，對(duì)于不同年份的信陽毛尖樣品，HPLC法測(cè)得咖啡堿含量為3.90%~4.60%，而紫外分光光度法測(cè)得咖啡堿含量為4.83%~ 5.33%，HPLC法測(cè)得的平均含量下降了15.8%。對(duì)于不同年份的信陽紅茶樣品，HPLC法測(cè)得咖啡堿含量為4.92%~5.49%，而紫外分光光度法測(cè)得咖啡堿含量為6.01%~ 6.48%，HPLC法測(cè)得的平均含量下降了15.7%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，高效液相色譜法相對(duì)于紫外分光光度法測(cè)定的咖啡堿含量下降了近16%，綠茶和紅茶下降比例相當(dāng)。

由圖3~4知，信陽紅中咖啡堿含量高于信陽毛尖。因?yàn)橐环矫婕t茶是通過發(fā)酵加工制作而得，而綠茶沒有經(jīng)過發(fā)酵，相關(guān)研究顯示茶葉發(fā)酵時(shí)間越長，咖啡堿含量就會(huì)越多，相同原料制成的紅茶咖啡堿含量普遍高于綠茶[3~6]；另一方面，咖啡堿在溫度達(dá)到178℃時(shí)開始變?yōu)闅怏w升華，文新信陽毛尖經(jīng)殺青、生鍋、熟鍋炒制而成，相關(guān)研究顯示從鮮葉采摘到炒茶工序咖啡堿含量變化相對(duì)較大，不斷降低[7]，而紅茶不經(jīng)過以上工序，這也是紅茶咖啡堿含量高于綠茶的原因之一。

對(duì)比2015~2018年相同級(jí)別的同種茶葉，咖啡堿含量與保存年限之間無明顯相關(guān)性。因?yàn)椴煌攴蓍g氣候不同，供試茶樣的采摘日期也不完全相同，采摘期茶葉品質(zhì)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程[8]，因此供試茶樣本身咖啡堿含量不完全一致。茶咖啡堿含量與茶樹生長代謝有著密切關(guān)系，茶葉新梢哪里生長旺盛，哪里的咖啡堿含量越多[9]；茶樹哪個(gè)時(shí)期長得快，哪個(gè)季節(jié)的咖啡堿含量越多，夏茶比春茶含量高[10]。

4 小結(jié)與討論

兩種方法均為水溶液提取，它具有無毒、揮發(fā)性小、可操作性強(qiáng)的特點(diǎn)。

用HPLC法測(cè)定茶葉中咖啡堿含量，操作簡(jiǎn)單，快速、準(zhǔn)確。因?yàn)镠PLC是通過流動(dòng)相帶著樣品在固定相/流動(dòng)相之間反復(fù)吸附-解吸附使樣品各組分完全分離，有選擇性強(qiáng)、專屬性好、靈敏度高的特點(diǎn)。分析一個(gè)樣品，最重要的就是樣品的專屬性，因此用HPLC測(cè)定的準(zhǔn)確度要比一般沒有經(jīng)過徹底分離的高。

紫外分光光度法樣品前處理是將茶湯經(jīng)過絡(luò)合沉淀步驟，然后兩次過濾，其操作過程繁瑣，工作量較大。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，紫外分光光度法的測(cè)定結(jié)果大于HPLC法。原因可能是分光光度法測(cè)得的咖啡堿包含了與咖啡堿結(jié)構(gòu)類似的嘌呤堿及其它物質(zhì)，所測(cè)結(jié)果不夠精準(zhǔn)，這是分光光度法的局限性，這種局限性在周順珍的研究結(jié)果中也有說明[11]。

此外，GB/T 8312-2013紫外分光光度法中設(shè)計(jì)的咖啡堿標(biāo)曲梯度最高濃度為0.012mg/ml，對(duì)應(yīng)吸光度為0.568，如果樣品測(cè)定依照國標(biāo)準(zhǔn)確吸取10ml試液進(jìn)行反應(yīng)、過濾，之后測(cè)吸光度，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大部分樣品的吸光度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高吸光度，并且部分信陽紅樣品的吸光度將大于0.8?？紤]到紫外分光光度法檢測(cè)器的工作原理，為保證測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)控制吸光度在0.2~0.7之間，透光率在20%~65%之間[12]。故本研究中樣品測(cè)定相比國標(biāo)有所調(diào)整，第一步吸取試液量為國標(biāo)的一半（5ml），從而使樣品吸光度全部在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。由此可見，采用紫外分光光度法測(cè)定茶葉中咖啡堿含量時(shí)，若樣品吸光度超過標(biāo)曲的吸光范圍，甚至大于0.8，為保證實(shí)驗(yàn)科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)，應(yīng)將試液稀釋后再使用，或者第一步反應(yīng)試液用量減半。

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S571.1

A

1006-5768（2019）03-110-05

2019-01-16

信陽市科技成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目：信陽毛尖茶精細(xì)化、智能化生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用（150002）。

余艷芳（1989—），女，河南信陽人，碩士研究生，從事茶葉生化分析與檢測(cè)研究。Email:576400501@qq.com

（責(zé)任編輯：蔣文倩）