普 睿 朱 琳 夏婷婷 畢皓然 孫鴻儒 黃 浩 張 磊 趙亞雙

大腸癌(Colorectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，全球每年死于大腸癌的患者高達800 792人，其死亡率在死亡順位上排在第二位。在我國，大腸癌的死亡率位列全部腫瘤死亡率的第三位，大腸癌患者平均5年生存率僅為56.9%左右[1]。目前，影響大腸癌預后生存的因素主要包括遺傳學和表觀遺傳因素及臨床病理因素等，但機制尚不明確[2]。近年來，大量獨立的試驗研究結果提示，特異性DNA甲基化可作為判斷大腸癌患者預后的生物標志物。JAK-STAT信號通路的異常激活會導致細胞周期的失調，影響腫瘤細胞浸潤轉移，影響患者的存活狀態(tài)[3]。

因此，本研究在239例大腸癌術后患者的隊列中檢測JAK-STAT通路主要基因STAT1及STAT3基因甲基化狀態(tài)并分析其與大腸癌預后的關系，并進一步分析影響大腸癌患者的預后因素。

1 資料與方法

1.1 資料來源

收集2004年7月—2005年7月與2007年5月—2008年1月期間在哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院接受手術治療的，經病理確診為原發(fā)性散發(fā)大腸癌患者。入院后記錄患者的一般人口學資料及臨床病理資料，采集術前靜脈血液樣本5 mL，排除患者手術前進行過放化療的病例、術后30天之內死亡的病例。術后對患者每年進行一次電話隨訪，記錄患者的生存情況，最后一次隨訪日期是2014年3月15日。總生存時間為患者接受手術后第一天直至死亡或失訪或到最后一次隨訪時間。死亡病例信息由家屬或相應的聯(lián)系人提供。

1.2 研究方法

采用特異性高分辨率熔解曲線(MS-HRM)分析，通過與標準品熔解曲線比較位置和形狀間的差異，檢測特定基因的甲基化程度。

1.3 統(tǒng)計學方法

運用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Kaplan-Meier法計算生存時間，并繪制生存曲線，生存曲線的比較采用Log-rank檢驗。應用單因素及多因素Cox比例風險模型分析STAT1，STAT3基因甲基化狀態(tài)以及臨床病理因素與大腸癌預后之間的關系，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般人口學資料

本研究共納入239名大腸癌患者，男性147例(61.50%)，女性92例(38.50%)，年齡25～78(56.60±11.60)歲，對全部研究對象隨訪，隨訪過程中124人(51.90%)存活，96人(40.20%)死亡，19人(7.90%)失訪，全部研究對象的基本特征見表1。

表1 研究對象的一般人口學特征

2.2 患者生存率

本研究納入239例大腸癌術后患者，中位總生存時間為83個月，1年生存率為94.90%，3年生存率為86.00%，5年生存率為67.20%(表2)。

表2 大腸癌患者不同性別、年齡、部位的生存率

2.3 影響大腸癌預后生存的單因素分析

2.3.1 STAT1，STAT3基因與大腸癌預后的單因素分析 經Log-Rank檢驗和Cox單因素分析顯示，STAT1，STAT3基因甲基化狀態(tài)與大腸癌預后總生存時間無關(圖1-2，表3)。

圖1 大腸癌患者外周血STAT1基因甲基化狀態(tài)與預后Figure 1 Methylation status and prognosis of STAT1 gene in peripheral blood of patients with colorectal cancer

圖2 大腸癌患者外周血STAT3基因甲基化狀態(tài)與預后Figure 2 Methylation status and prognosis of STAT3 gene in peripheral blood of patients with colorectal cancer

表3 STAT1，STAT3基因與大腸癌預后關系分析

2.3.2 臨床病理因素與大腸癌預后的單因素分析 將一般人口學資料和臨床病理因素納入單因素Cox比例風險模型，結果顯示術中使用腸吻合器和Dukes分期可能與大腸癌患者預后有關(表4)。

表4 臨床病理因素與大腸癌預后關系的生存分析

2.4 影響大腸癌預后生存的多因素分析

將單因素分析存在統(tǒng)計學差異的臨床病理學因素及STAT1和STAT3基因甲基化情況納入多因素Cox比例風險模型分析。結果顯示，術中腸吻合器的使用和Dukes分期為大腸癌患者預后的影響因素，STAT1和STAT3基因甲基化狀態(tài)與大腸癌預后狀態(tài)無關(表5)。

表5 大腸癌預后生存的多因素生存分析

3 討論

近年來，雖然大腸癌的死亡率在全球范圍內呈下降趨勢，但發(fā)展中國家大腸癌的死亡人數(shù)占全球的52%，且生存率徘徊在22.5%～65%[4]。馬來亞大學醫(yī)學中心(UMMC)進行的一項雙向隊列研究表明與馬來人和印度人相比，中國患者的5年生存率最低[5]。研究大腸癌患者術后生存的影響因素，可作為臨床診治方案的參考，對于提升患者生命質量有重要意義。

大腸癌的侵襲、復發(fā)、轉移是多步驟、多因素、多基因的復雜過程，每一階段都受多種基因/蛋白質的調控。DNA甲基化主要發(fā)生在編碼基因啟動子區(qū)CpG島上，其可以通過抑制DNA與轉錄因子的識別與結合、促進CpG結合蛋白向基因啟動子區(qū)募集等機制抑制基因轉錄，使相應的基因表達下調或不表達。一般來說，DNA甲基化程度越高，這段DNA被轉錄成RNA并翻譯成有功能蛋白質的可能性就越小。JAK-STAT信號通路的異常激活導致細胞周期的失調，因而與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲等密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌組織中JAK及STAT持續(xù)激活，而在正常上皮中缺失，同時結果顯示抑制JAK-STAT信號的活化能抑制腫瘤增殖和生長[6-9]。在微陣列免疫組織化學分析對414例大腸癌腫瘤樣本進行的檢測中發(fā)現(xiàn)：高STAT1活性與患者總體存活率較高顯著相關，STAT3高表達與大腸癌患者總生存期增加約30個月相關，STAT3被確定為預測疾病結果的獨立因子[10]。另外，在104例晚期直腸癌中磷酸化STAT3(p-STAT3)的核免疫組化表達的研究中，結果顯示具有p-STAT3陽性的腫瘤的患者具有較高的總體存活率[11]。而IGF2BP3基因參與細胞生長和遷移，已被證明是一種參與癌癥發(fā)生發(fā)展的原癌基因，且甲基化狀態(tài)可作為指導結直腸癌分化和預后的生物學標志物[12]。JAK-STAT通路與其有相似的生物學作用，故本研究選擇JAK-STAT通路內的STAT1和STAT3基因進行甲基化的檢測。

本研究239例大腸癌患者切除術后5年生存率為67.20%。該結果與國內蔡善榮等人報道842例大腸癌患者的5年生存率為66.30%以及與韓國Park等報道的2 230例大腸癌的5年生存率為67.20%相近[2，13]。

本研究結果顯示，性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大體分型、組織學分型、術后化療、STAT1以及STAT3基因甲基化狀態(tài)與大腸癌患者術后生存率無相關性。Dukes分期是反映腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和遠處轉移的綜合指標，許多研究已證實，Dukes分期是大腸癌預后的重要影響因素，生存率隨Dukes分期依次下降[14]。楊艷芳等人的研究結果顯示，Dukes分期每增加一期，其死亡風險即為上一期的3.06倍[15]。本研究顯示Dukes分期不僅是影響大腸癌預后的獨立因素，在多因素分析中也對患者生存期產生影響，與A期和B期患者相比，C期和D期患者死亡風險增加了0.33倍。由此我們推測，Dukes分期可作為推測大腸癌患者臨床結局的可靠指標。

鮮有研究數(shù)據(jù)關于吻合器應用對大腸癌治愈率和生存率的影響，我們的結果表明使用腸吻合器患者的5年生存率是74.60%，不使用腸吻合器患者的5年生存率是47.50%。已有資料顯示吻合器的廣泛應用使低位直腸癌手術的保肛率增加，管狀吻合器在大腸癌合并梗阻時的應用中，可縮短手術時間，減少深部操作的困難，減少并發(fā)癥的發(fā)生，提高生存率[16]。鄧純禹[17]對比了手工縫合治療和使用直腸吻合器的低位直腸癌前切除術患者共70例，經生活質量評分表調查顯示使用腸吻合器患者各項評分均優(yōu)于手工縫合治療患者，而且降低了術后吻合口漏的并發(fā)癥發(fā)生率，對于術者來說，使用腸吻合器也更加方便、安全，降低手術難度。據(jù)此我們推測，腸吻合器的使用通過提高患者術后生活質量，從而影響到預后生存期，更多的資料和證據(jù)尚待進一步研究。

本研究首次在中國人群中檢測外周血STAT1，STAT3基因甲基化狀態(tài)與大腸癌預后的關系，但尚未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學意義，需要更大樣本的研究來證實。我們的研究結果顯示Dukes分期和術中腸吻合器的使用是影響大腸癌患者預后的重要因素，我們需要同時考慮腫瘤的大小、浸潤深度、分化程度、手術方法以及患者的健康水平等[18]。

綜上所述，大腸癌患者中Dukes分期為更高者死亡風險增加，術中使用腸吻合器患者預后優(yōu)于未使用者，外周血STAT1，STAT3基因甲基化狀態(tài)尚不能作為影響大腸癌患者預后的生物標志物，仍需要更大樣本的深入研究。