李 景 吳華珍 劉繼瑣

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，占全球人類癌癥的12%。據估計，在2015年全球有56萬例新發(fā)病例和29萬例宮頸癌死亡病例[1-3]。宮頸癌患者局部晚期疾病和轉移性疾病的5年總生存率分別為30%～50%和5%～15%[4-5]。miR-362通過直接靶向Gli3發(fā)揮其抗增殖功能，并通過在體外和體內抑制宮頸癌生長而起到腫瘤抑制劑的作用[6-8]。miR-362參與DNA甲基轉移酶1(DNMT1)的調節(jié)，以在體外和體內抑制肝癌細胞增殖和轉移。Six1是Six家族的同源域的成員，位于人類染色體14q23(34)上[9]。Six1在細胞增殖、細胞周期進程、細胞凋亡、細胞分化和血管生成中起重要作用[10]。此外，據報道Six1受miRNA調節(jié)，例如肺癌中的miR-134和急性髓性白血病中的miR-370。本研究擬探討miR-362靶向Six1抑制宮頸癌細胞增殖、遷移的作用機制，為宮頸癌的治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2012年4月—2013年8月在我院行手術切除并經病理證實的宮頸癌患者142例為宮頸癌組，獲得宮頸癌組織和配對的癌旁組織(離腫瘤3 cm，病理未發(fā)現癌細胞)，將其儲存在-80℃冰箱，直至進行RNA提取。該研究經我院醫(yī)學倫理協會批準，患者及家屬簽署知情同意。

1.2 宮頸癌組織及癌旁正常組織miR-362表達水平測定

使用TRIzol試劑按照制造商的說明從組織或細胞中提取總RNA。使用Applied Biosystems 7900HT RT-PCR系統(tǒng)進行逆轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)。為了量化miR-362的表達，使用以下方法合成互補DNA(cDNA)，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit逆轉錄，然后用TaqMan MicroRNA PCR Kit進行qPCR。研究中使用的引物如下：miR-362：5′-ACACTCCAGCTGGGCTCCTATATGATGC-3′，5′-ACTCCACGACACCAGTTGAG-3′。U6：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。U6用作miR-362 mRNA表達的內源對照。用2-ΔΔCt方法計算miR-362的相對水平。

1.3 Hela細胞培養(yǎng)及分組設計

宮頸癌細胞系Hela細胞來源于中國科學院細胞中心(中國上海)，在Dulbecco′s Modified Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)，加入10%胎牛血清(FBS)、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素；所有細胞在37℃含有5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

分組設計：Hela宮頸癌組：取5×106Hela宮頸癌細胞于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、20% O2)；miR-362mimics、miR-362 inhibitor組：取10 mL轉染miR-362 mimics、miR-362inhibitor的Hela宮頸癌細胞液于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、2% O2)。以上各組每孔設6個平行樣，培養(yǎng)72 h。

Hela宮頸癌細胞株miR-362mimics、miR-362inhibitor轉染：取5×106Hela宮頸癌細胞液接種于6孔板，細胞長到60%～70%匯合的密度時，用Lipofectamine 2000試劑按照制造商的說明書進行細胞轉染。轉染步驟如下：取100pmol的miR-362mimics、miR-362inhibitor于200 μL DMEM培養(yǎng)基中，取4 μL lipofectamine2000于200 μL DMEM培養(yǎng)基中，混勻lipofectamine2000和miRNA液，室溫培育30 min，無菌PBS洗滌細胞，將混合液加入細胞孔內，6 h后棄混合液，加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉染后約24 h，流式細胞儀檢測轉染效情況。miR-362mimics、miR-362inhibitor獲自上海藍基因生物科技有限公司。

1.4 癌細胞活力的MTT法檢測及癌細胞單克隆形成數目檢測

通過使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)測定來評估細胞增殖。收集轉染的各組細胞并以每孔2，000個細胞的密度接種在96孔板中。然后將細胞在37℃下在含有5%CO2和100%濕度的條件下孵育72 h。向每個孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，隨后在37℃下再孵育4 h。小心丟棄含有MTT溶液的培養(yǎng)基，并加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)以溶解甲crystals沉淀物。使用自動多孔分光光度計(Bio-Rad)測量490 nm處的光密度(OD)值。

1.5 癌細胞單克隆形成數目檢測

轉染24 h后，將各組細胞用胰蛋白酶處理，計數，并以密度為1 000個細胞/孔在6孔板中接種用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)8天。每3天更換培養(yǎng)基以維持細胞生長。培養(yǎng)8天后，將菌落固定并用0.5%結晶紫在室溫下染色30 min。在倒置顯微鏡下計數菌落數。

1.6 癌細胞凋亡及細胞周期檢測

通過使用膜聯蛋白V/熒光素異硫氰酸酯(FITC)細胞凋亡試劑盒檢測細胞凋亡。將在6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細胞用胰蛋白酶消化，洗滌，在黑暗中用FITC綴合的抗膜聯蛋白V抗體染色。在室溫下15 min，然后通過流式細胞術(BD Biosciences)分析。每個實驗重復三次。使用FACS Calibur系統(tǒng)測試標記的各組細胞，并測定凋亡百分比及細胞周期。

1.7 Transwell細胞侵襲實驗

收獲轉染的各組細胞，用無FBS DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次，然后重懸于無FBS的DMEM培養(yǎng)基中。將總共1×105個細胞加入到涂有Matrigel的Transwell培養(yǎng)板的上室中。將含有20%FBS的約600 μL DMEM加入Transwell培養(yǎng)板的下室中。在37℃和5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中孵育48 h后，用棉簽小心地除去殘留在膜上表面的細胞。滲透到膜下表面的細胞用4%多聚甲醛固定，用0.5%結晶紫染色，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，并在空氣中干燥。在光學顯微鏡下對侵入的細胞進行計數。

1.8 Hela宮頸癌細胞iR-362、Six1 mRNA水平測定

實時熒光定量PCR測定各組miR-362、Six1 mRNA表達水平。Six1正向引物：5′-GTTAGCCTTGTCTTTACT-3′，反向引物：5′-ACTGCTACTGTTCGACAGAATCG-3′。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 癌旁組織、宮頸癌組織中miR-362mRNA表達水平的比較

宮頸癌組織miR-362mRNA表達水平低于癌旁組織(P<0.05)(表1)。

表1 癌旁組織、宮頸癌組織中miR-362mRNA水平的表達

2.2 miR-362表達與臨床病理特征的關系

以宮頸癌組miR-362 mRNA中位數0.94為判定點，<0.94為低表達，≥0.94為高表達；有淋巴血管間隙浸潤、病理學分期越高、TNM分期越高、有淋巴結轉移、浸潤深度越深時，miR-362mRNA表達率越低，miR-362表達與淋巴血管間隙浸潤、病理學分級、TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度有關(P<0.05)(表2)。

2.3 各組Hela癌細胞OD值、存活率水平的表達

miR-362mimics組OD值、存活率水平低于Hela癌細胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組OD值、存活率水平高于Hela癌細胞組、miR-362mimics組(P<0.05)(表3)。

2.4 各組Hela癌細胞單克隆形成數目的表達

miR-362mimics組克隆形成數目低于Hela癌細胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組克隆形成數目高于Hela癌細胞組、miR-362mimics組(P<0.05)(圖1，表4)。

表2 miR-362表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

表3 各組Hela癌細胞OD值、存活率水平的表達

Note：bP<0.05，compared with Hela cancer cells group；cP<0.05，compared with miR-362 mimics group.

表4 各組Hela癌細胞克隆形成數目的表達

Note：bP<0.05，compared with Hela cancer cells group；cP<0.05，compared with miR-362mimics group，.

2.5 各組Hela癌細胞凋亡率的表達

miR-362mimics組細胞凋亡率高于Hela癌細胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組細胞凋亡率低于Hela癌細胞組、miR-362mimics組(P<0.05)(表5)。

2.6 各組Hela癌細胞G1期比較

miR-362mimics組G1期高于Hela癌細胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組G1期低于Hela癌細胞組、miR-362mimics組(P<0.05)(圖2，表6)。

表5 各組Hela癌細胞凋亡率的表達

Note：bP<0.05，compared with Hela cancer cells group；cP<0.05， comparedwith miR-362mimics group.

2.7 各組Hela癌細胞穿膜數的表達

miR-362 mimics組細胞穿膜數低于Hela癌細胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組穿膜數高于Hela癌細胞組、miR-362 mimics組(P<0.05)(表7，圖3)。

圖1 各組Hela癌細胞克隆形成數目比較Figure 1 Comparison of the number of colony formation of Hela cancer cells in each group Note：A：Hela cells group；B：miR-362mimics group；C：miR-362inhibitor group.

圖2 各組Hela癌細胞G1期比較Figure 2 Comparison of G1 Phase of Hela Cancer Cells in Different GroupsNote：A：Hela cancer cells group，B：miR-362mimics group，C：miR-362inhibitor group.

表6 各組Hela癌細胞G1期比較

Note：bP<0.05，compared with Hela cancer cells group.cP<0.05，compared with miR-362mimics group.

表7 各組Hela癌細胞穿膜數的表達

Note：bP<0.05，compared with Hela cancer cells group；cP<0.05，compared with miR-362mimics group.

圖3 各組Hela癌細胞G1期比較Figure 3 Comparison of G1 phase of Hela cancer cells in each group Note：A：Hela cancer cells group，B：miR-362mimics group，C：miR-362inhibitor group.

2.8 各組Hela癌細胞miR-362、SIX1 mRNA表達水平比較

miR-362mimics組miR-362 mRNA表達水平高于Hela癌細胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組miR-362 mRNA表達水平低于Hela癌細胞組、miR-362mimics組(P<0.05)。miR-362mimics組Six1 mRNA表達水平低于Hela癌細胞組(P<0.05)，miR-362inhibitor組Six1 mRNA表達水平高于Hela癌細胞組、miR-362mimics組(P<0.05)(表8)。

表8 各組Hela癌細胞miR-362、SIX1 mRNA表達水平比較

Note：bP<0.05，compared with Hela cancer cells group；cP<0.05，compared with miR-362mimics group.

3 討論

越來越多的證據表明，miRNA在正常細胞特征和病理狀態(tài)中都發(fā)揮著重要作用。這些miRNA可通過調節(jié)其靶基因而充當腫瘤抑制因子或癌基因。因此，鑒定宮頸癌中癌癥特異性miRNA及其靶基因對于理解它們在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用是至關重要的，并且可以作為新的治療靶標進行研究。目前已經在各種類型的癌癥中研究了miR-362的表達。例如，在乳腺癌中，與對照CCD-1095Sk細胞系相比，發(fā)現miR-362在MDA-MB-231和MCF7細胞系中顯著下調；慢性粒細胞白血病細胞系和慢性粒細胞白血病患者的新鮮血液樣本中miR-362的表達水平較低；在肝細胞癌中鑒定出明顯的miR-362下調，并且與腫瘤進展顯著相關；在胃癌中，miR-362表達在腫瘤組織和細胞系中下調[11]。miR-362是CCL20的正向調節(jié)物，CCL20的過度表達抑制分化和結節(jié)轉移，因此miR-362與CCL2030 UTR的結合能抑制惡性腫瘤[12-13]。同時，許多miRNA在宮頸癌中被下調并且充當腫瘤抑制劑。一項研究通過MTT法和流式細胞術評估肝癌細胞的生長和凋亡，發(fā)現miR-362的過表達通過調節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路靶向磷酸肌醇3-激酶催化亞基δ(PIK3CD)抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡和降低致瘤性。本研究結果顯示，宮頸癌組miR-362mRNA表達水平低于癌旁組；淋巴血管間隙浸潤、病理學分期越高、TNM分期越高、有淋巴結轉移、浸潤深度越深，miR-362mRNA表達率越低，miR-362表達與淋巴血管間隙浸潤、病理學分級、TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度相關性明顯；Hela宮頸癌細胞體外試驗表明，miR-362過表達可降低Hela宮頸癌細胞增殖、侵襲水平，增加Hela宮頸癌細胞凋亡水平。這與上述討論符合，同時提示miR-362在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了腫瘤抑制作用。

Six1作為轉錄因子參與多種生物過程，包括癌癥。已在多種腫瘤細胞系和腫瘤組織中檢測到Six1表達增加，表明Six1對腫瘤細胞增殖和生長至關重要。Six1的表達升高與腫瘤惡性相關[14]。在乳腺癌、結直腸癌、食管鱗狀細胞癌和胰腺癌中發(fā)現了Six1的異常升高。大量證據表明Six1有助于腫瘤發(fā)生。SIX1表達增加促進血管生成、侵襲和轉移[15]。在胰腺癌細胞中，SIX1表達下調減少了MMP-2、MMP-9和VEGF的表達，從而抑制血管生成、侵襲和遷移[16]。此外，一系列研究報道了Six1在腫瘤發(fā)生中的功能可以通過miRNA調節(jié)。例如，下調的miR-370通過上調急性髓性白血病(AML)中的Six1而促進增殖和細胞衰老[17]。研究已證實在宮頸癌中，Six1表達上調，Six1的表達水平與宮頸癌的臨床分期、分化和淋巴結轉移顯著相關?？紤]到Six1在宮頸癌中的重要性和作用，它可以作為宮頸癌患者的治療靶點。本研究結果顯示，miR-362mimics組Six1 mRNA表達水平低于Hela癌細胞組，miR-362inhibitor組Six1 mRNA表達水平高于Hela癌細胞組、miR-362mimics組。提示miR-362過表達可抑制Hela癌細胞Six1的表達，miR-362通過負調節(jié)Six1抑制細胞增殖、遷移和侵襲。miR-362可用作抑制人宮頸癌生長和轉移的治療靶標。

綜上所述，miR-362在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了腫瘤抑制作用；其機制與miR-362通過負調節(jié)Six1抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲有關。