閆若東 任 山 隋文印 樸仁京

跨膜蛋白(Transmembrane protein，TMEM)是一種跨生物膜的蛋白質(zhì)，絕大部分貫穿細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層，少數(shù)位于細(xì)胞器膜上，是線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體膜及高爾基體膜的重要組成成分[1]。大多數(shù)TMEM家族中的蛋白功能尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，TMEM45A參與腫瘤的增殖、侵襲及化療敏感性[1]。然而，TMEM45A在腎透明細(xì)胞癌(Clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)中的表達(dá)及作用尚無研究。本研究通過對公共數(shù)據(jù)庫的挖掘，分析TMEM45A在ccRCC中的表達(dá)及與ccRCC分期、預(yù)后的關(guān)系，并利用細(xì)胞實驗研究其對腎癌細(xì)胞增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

我們在Oncomine數(shù)據(jù)中根據(jù)自己的需求設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件。本研究中，(1)“Analysis Type：Clear Cell Renal Cell Carcinoma vs Normal Analysis”；(2)“Gene：TMEM45A”；(3)“Data Type：mRNA”；(4)臨界值設(shè)定條件(P<0.0001，fold change>2，gene rank=top 10%)作為我們的篩選條件。由于Oncomine數(shù)據(jù)庫非免費(fèi)，我們先下載Oncomine官網(wǎng)上的源代碼，然后利用R語言中的devtools和Oncomine包提取代碼中的臨床數(shù)據(jù)，最后對提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析

在GEPIA數(shù)據(jù)庫(http：//gepia.cancer-pku.cn)中輸入TMEM45A，選擇樣本數(shù)據(jù)庫中的腎透明細(xì)胞癌，分析TMEM45A的表達(dá)水平及其與腎透明細(xì)胞癌分期、總生存時間(OS)及無病生存時間(DFS)的關(guān)系。以中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組對樣本進(jìn)行生存分析。

1.3 組織標(biāo)本

收集2015年1月—2018年12月在盤錦市中心醫(yī)院行手術(shù)治療且術(shù)后病理確診為腎透明細(xì)胞癌的15對配對腎透明細(xì)胞癌及正常腎臟冰凍組織，其中男性9例，女性6例，平均年齡60.25±6.94歲，Grade Ⅰ：7例，Grade Ⅱ：4例，Grade Ⅲ：3例，Grade Ⅳ：1例。患者本人及其家屬同意留取組織標(biāo)本用于研究。本研究得到盤錦市中心醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人腎癌786-O、Caki-1和正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞株來自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫。使用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 qRT-PCR檢測TMEM45A mRNA的表達(dá)

使用Trizol提取組織和細(xì)胞中RNA，用TaKaRa試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。TMEM45A基因引物序列：上游：5′-CTCCTGGGCTGGCATCATTTC-3′，下游：5′-CGGCCATGAGTGTGGTTGTAG-3′；PCNA基因引物序列：上游：5′-GCCTGACAAATGCTTGCTGAC-3′，下游：5′-GCTGTTCTTGGCCTCAGTC-3′；Cyclin D1基因引物序列：上游：5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，下游：5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′；β-actin基因引物序列：上游：5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游：5′-TGCCCAGGAAGGAAGGCT-3′。

1.6 Western blot檢測TMEM45A蛋白

收集細(xì)胞，用含PMSF的裂解液提取總細(xì)胞蛋白。配制凝膠后每孔加入50 μg/孔，然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，TMEM45A抗體、PCNA抗體和Cyclin D1(工作濃度：1∶1 000，Cell Signaling Technology)4℃孵育過夜，加二抗(Cell Signaling Technology)封閉液孵育2 h后ECL試劑(Boster)顯色，具體步驟參考相關(guān)文獻(xiàn)[2]。

1.7 轉(zhuǎn)染

無義siRNA(NC)和三種針對TMEM45A siRNA(RNAi-1，RNAi-2，RNAi-3)由上海吉瑪公司設(shè)計合成。無義siRNA序列：5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′；RNAi-1序列：5′-GGCCUUUAUCUUCUACAACUU-3′；RNAi-2序列：5′-GUUCCUUGUUCGGAACAAUUU-3′；RNAi-3序列：5′-AGUGUACUGUUUGCAUUUCUU-3′。利用脂質(zhì)體Lipofectamin 2000(Invitrogen)作為載體將TMEM45A siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實驗。

1.8 CCK-8實驗

取對數(shù)生長期細(xì)胞，每孔3 000個細(xì)胞加入96孔板中，TMEM45A siRNA轉(zhuǎn)染Caki-1細(xì)胞6 h后換液，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入MTS試劑，2 h后酶標(biāo)儀檢測吸光度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TMEM45A在不同腫瘤中的表達(dá)

Oncomine數(shù)據(jù)庫中共收集了384項TMEM45A相關(guān)的研究，35項有統(tǒng)計學(xué)差異，其中25項TMEM45A高表達(dá)，10項TMEM45A低表達(dá)。4項腎癌相關(guān)的研究均顯示在腎癌中TMEM45A表達(dá)升高(表1)。

表1 Onconime數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤的TMEM45A表達(dá)情況

2.2 TMEM45A在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況

在Oncomine數(shù)據(jù)庫中我們發(fā)現(xiàn)，共有4項研

究涉及TMEM45A mRNA在腎透明細(xì)胞癌和正常組織中的表達(dá)，共有115例樣本(圖1)。在Oncomine數(shù)據(jù)庫中薈萃分析4項研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照相比，TMEM45A mRNA在所有差異表達(dá)基因中的中位數(shù)值排名為1 697.5，P=0.004，提示TMEM45AmRNA在腎透明細(xì)胞癌中高表達(dá)。利用R語言分別提取Gumz、Jones、Lenburg、Yusenko 4項研究的數(shù)據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)TMEM45A mRNA在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)高于正常組織(圖2)。

圖1 TMEM45A在不同腎透明細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況Figure 1 The expression of TMEM45A mRNA in different ccRCC datasets

圖2 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中TMEM45A mRNA在4個腎透明細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況Figure 2 The expression of TMEM45A mRNA in four ccRCC datasets in the Oncomine database

2.3 TMEM45A與腎透明細(xì)胞癌臨床分期預(yù)后的關(guān)系

為明確TMEM45A與腎透明細(xì)胞癌的臨床相關(guān)性，我們利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析TMEM45A與腎癌的分期和生存的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TMEM45A在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)越高，腎透明細(xì)胞癌的分期也越高，而總生存時間及無病生存時間越短(圖3)。

2.4 TMEM45A mRNA在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

利用qRT-PCR檢測15對配對的正常腎組織及腎透明細(xì)胞癌組織中TMEM45A mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常腎組織相比，腎透明細(xì)胞癌組織中TMEM45A mRNA顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖4)。

圖4 TMEM45A mRNA在15對配對腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)Figure 4 The expression of TMEM45A mRNA in 15 paired ccRCC tissuesNote：*P<0.05，when compared to the normal tissues.

圖3 TMEM45A表達(dá)與ccRCC分期及預(yù)后之間的關(guān)系Figure 3 The relationship between the expression of TMEM45A and the stage or survival of ccRCCNote：A.The expression of TMEM45A in ccRCC(T)and normal kidney tissue(N)；B.The relationship between the TMEM45A expression and the stage of ccRCC；C.The relationship between the TMEM45A expression and overall survival of ccRCC；D.The relationship between the TMEM45A expression and disease free survival of ccRCC.*P<0.05.

2.5 TMEM45A對腎癌細(xì)胞增殖的影響

TMEM45A mRNA和蛋白在腎癌細(xì)胞株786-0和Caki-1中的表達(dá)顯著高于HK-2細(xì)胞(P<0.001)(圖5A)。由于TMEM45A在Caki-1細(xì)胞中的表達(dá)較高，因此選擇Caki-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實驗。利用TMEM45A siRNA(RNAi-1，RNAi-2，RNAi-3)干擾Caki-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TMEM45A mRNA表達(dá)明顯下降，其中RNAi-2的抑制效率最高(圖5B)。CCK-8實驗結(jié)果顯示，抑制TMEM45A表達(dá)后，2 d、3 d后Caki-1細(xì)胞的增殖能力明顯受抑制(P<0.001)(圖5C)。

圖5 TMEM45A抑制后對細(xì)胞增殖的影響Figure 5 The effects of knockdown TMEM45A on cell proliferation in three kidney cell linesNote：A.The expression of TMEM45A mRNA and protein in three kidney cell lines；B.The influence on TMEM45A mRNA with different TMEM45A siRNAs；C.the influence on cell proliferation after inhibition of TMEM45A.*P<0.05，** P<0.001，when compared to the control group.

2.6 TMEM45A對細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的調(diào)控作用

為明確抑制TMEM45A后Caki-1細(xì)胞增殖能力下降的潛在調(diào)控機(jī)制，本研究利用siRNA抑制TMEM45A表達(dá)后檢測細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA和Cyclin D1的變化。結(jié)果顯示，抑制TMEM45A后，PCNA和Cyclin D1的蛋白及mRNA表達(dá)均下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖6)。

圖6 抑制TMEM45A后對細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響Figure 6 The influence on cell proliferation related proteins after inhibition of TMEM45ANote：A.The expression of TMEM45A，PCNA and cyclin D1 protein was detected by Western blot；B.The expression of TMEM45A，PCNA and cyclin D1 mRNA was detected by qRT-PCR.*P<0.05，when compared to the control group.

3 討論

跨膜蛋白45A(TMEM45A)，屬于TMEM蛋白大家族，由275個氨基酸，約有5到7個跨膜結(jié)構(gòu)域，位于高爾基體上。據(jù)報道，TMEM45A參與表皮的角化[3-5]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌[5]、膀胱癌[6]、宮頸癌[7]和卵巢癌[8-9]中TMEM45A的表達(dá)明顯升高，與腫瘤患者的預(yù)后不良密切相關(guān)[5，10]。與正常腦組織相比，TMEM45A在膠質(zhì)瘤組織中顯著高表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)隨著膠質(zhì)瘤組織學(xué)分級的增加，TMEM45A mRNA水平逐漸增加且與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)。TMEM45A siRNA處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞后顯著下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)(細(xì)胞周期蛋白D1，CDK4和PCNA)從而降低細(xì)胞增殖能力；同時通過下調(diào)細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白(MMP-2和MMP-9)抑制細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲[10]。研究發(fā)現(xiàn)在紫杉醇耐受的乳腺癌細(xì)胞中TMEM45A明顯升高；利用siRNA沉默TMEM45A可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞對化療藥物的耐受，說明TMEM45A在低氧導(dǎo)致的化療耐受中起重要的作用；同時發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的TMEM45A與乳腺癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)[5]。Guo等研究發(fā)現(xiàn)TMEM45A在卵巢癌中高表達(dá)，沉默后顯著下調(diào)TGF-β1、TGF-β2、RhoA和ROCK2的表達(dá)，顯著抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)G1期阻滯及抑制細(xì)胞侵襲。因此，TMEM45A在卵巢癌中起致癌基因的作用，可作為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)[9]。Thibodeau等通過對16例低分級、14例高分級的腎透明細(xì)胞癌及14例正常腎臟組織及6例良性腎疾病組織進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)TMEM45A mRNA在高分級的腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)明顯升高，且與細(xì)胞的分化過程及對低氧的反應(yīng)相關(guān)[11]。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)10個TMEM家族的基因在腎透明細(xì)胞中異常表達(dá)，僅TMEM45A和SLC35G2在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)升高[12]。目前對TMEM45A在腎透明細(xì)胞癌中的研究不多，具體的作用及臨床意義尚不明確。

本研究我們利用Oncomine數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)TMEM45A mRNA在Gumz等[13]、Jones等[14]、Lenburg等[15]、Yusenko等[16]4項研究中表達(dá)升高。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析顯示，TMEM45A mRNA的表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌的臨床分期、總生存時間及無病生存期密切相關(guān)。腎癌患者的存活很大程度上取決于腫瘤的臨床分期，因此TMEM45A可作為評估腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后好壞的標(biāo)志物。同時我們在腎透明細(xì)胞癌組織中對數(shù)據(jù)庫挖掘的結(jié)果進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)TMEM45A mRNA在ccRCC組織中高表達(dá)。為明確TMEM45A在腎癌細(xì)胞中的作用及調(diào)控機(jī)制，我們利用qRT-PCR和Wenstern blot檢測HK-2、786-0和Caki-1細(xì)胞株中TMEM45A mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示TMEM45A在Caki-1細(xì)胞中表達(dá)相對較高；利用針對TMEM45A的siRNA抑制Caki-1細(xì)胞的TMEM45A表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力及PCNA和Cyclin D1表達(dá)明顯下降，說明TMEM45A可能直接或間接地調(diào)控PCNA和Cyclin D1參與腎癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，TMEM45A在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)顯著升高，且與臨床的分期、總生存時間及無病生存時間密切相關(guān)，有望成為判斷腎透明細(xì)胞癌預(yù)后的標(biāo)志物。體外細(xì)胞實驗證實抑制TMEM45A后可顯著降低腎癌細(xì)胞的增殖能力及PCNA和Cyclin D1的表達(dá)，為腎癌靶向治療提供新的思路。本研究通過對公共數(shù)據(jù)庫的挖掘，為我們的基礎(chǔ)研究提供可靠的理論依據(jù)，為順利開展實驗提供保障。由于本研究中臨床組織的樣本量不夠大，因此存在一定的不足。我們將繼續(xù)收集腎癌的手術(shù)標(biāo)本，擴(kuò)大樣本量，同時積極收集腎癌患者的臨床資料及密切隨訪，進(jìn)一步探討其與腎癌的臨床分期、分級及預(yù)后關(guān)系。