劉金濤 高 玲 周會會

肺癌是最普遍的惡性腫瘤之一，肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移顯著影響患者的預(yù)后，因此，發(fā)現(xiàn)早期標(biāo)記物對肺癌臨床治療早期療效的判斷具有重要意義[1-2]。黑素瘤抗原家族A4(Melanoma antigen family A4，MAGEA4)在各種惡性腫瘤中表達(dá)，MAGEA4被廣泛用作癌癥疫苗治療的靶標(biāo)[3-4]。MAGEA4可作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)發(fā)育和功能的主要調(diào)節(jié)劑[5-6]。人末端結(jié)合蛋白1(Human end-binding protein 1，EB1)最初被鑒定為腺瘤性結(jié)腸息肉(APC)的相互作用配偶體，其作用是增強(qiáng)結(jié)腸直腸癌中的APC功能[7-8]。最近的研究表明，EB1與各種系統(tǒng)中的微管介導(dǎo)的細(xì)胞活動有關(guān)，包括遷移、細(xì)胞分裂和形態(tài)發(fā)生。值得注意的是，據(jù)報道EB1在胃腺癌、肝細(xì)胞癌、食道鱗狀細(xì)胞癌和乳腺癌中過表達(dá)[9]。本研究擬探討MAGEA4和EB1蛋白在肺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，為肺癌的診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2010年3月—2012年5月在我院胸外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的肺癌患者136例為研究對象，符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)公布的2012版《NCCNCRC診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。手術(shù)中切除標(biāo)本后行病理檢查以判定臨床病理特征。同時取距肺癌組織5 cm以上的正常肺組織為癌旁組織?；颊咦栽柑峁┎±砑罢７谓M織，用作分析MAGEA4、EB1 mRNA、蛋白的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系。該研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理協(xié)會批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 MAGEA4和EB1 mRNA在肺癌組織及癌旁組織中表達(dá)的測定

使用RNeasy Mini Kit，根據(jù)制造商的說明書從肺癌組織及癌旁組織中提取總RNA，并用RQ1 RNase-Free DNase消化。然后使用Superscript II或Superscript VILO cDNA合成試劑盒從2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，并用核糖核酸酶H消化。然后使用MAGEA4正向引物，5′-ATGTCTTCTGAGCAGAAGAGTCAGC-3′和MAGEA4反向引物，5′-TCAGACTCCCTCTTCCTCCTCT-3′；EB1正向引物，5′-ACCTAGGCTGCAGAAGACTTAG-3′和MAGEA4反向引物，5′-TCAGACTCACC-3′，內(nèi)參基因為β-肌動蛋白，其正向引物序列為5′-CCAGGCTGTGCTATCCCTGTACGC-3′和反向引物5′-ACCGGAGTCCATCACGATGC-3′。用GoTaq DNA聚合酶擴(kuò)增MAGEA4、EB1。反應(yīng)包括94℃預(yù)熱5min和94℃下變性30 s 30個循環(huán)，60.4℃退火30 s，72℃延伸1 min，然后在72℃延伸5 min。使用PowerSYBR?-Green PCR Master Mix，通過ABI PRISM7000上的定量RT-PCR評估MAGEA4、EB1表達(dá)，β-肌動蛋白作為內(nèi)容基因，在與β-肌動蛋白比較后使用2-ΔΔCT方法計算相對表達(dá)。

1.3 MAGEA4和EB1蛋白在病理組織及癌旁組織中表達(dá)的測定

通過基于鏈霉抗生物素蛋白、生物素和過氧化物酶的免疫組織化學(xué)評估MAGEA4、EB1蛋白在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。病理組織、癌旁組織常規(guī)福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，在二甲苯中脫蠟并在一系列分級醇中脫水。然后將切片熱固定并阻斷過氧化物酶活性，然后與蛋白質(zhì)封閉溶液一起溫育。將樣品切片在4℃下用針對MAGEA4的單克隆抗體以1∶2000的稀釋度標(biāo)記過夜。為了染色EB1，將樣品在室溫下用針對人EB1的小鼠單克隆抗體標(biāo)記1 h。洗滌后，將切片在室溫下與過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠和抗兔多克隆IgG(Fab′)一起孵育30 min，然后與Histofne Simple Stain MAXPO(MULTI)一起孵育。進(jìn)一步洗滌后，用新鮮制備的3，3′二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽觀察樣品，用蘇木精復(fù)染并固定。用1∶20稀釋度的小鼠同種型IgG1和IgG2a混合物探測的Secimens用作陰性對照，而正常人睪丸用作陽性對照。使用雙盲法評估所有載玻片。對于每個切片，選擇5個高倍視野(400×放大倍數(shù))并在每個視野中計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞。將染色強(qiáng)度和陽性面積百分比組合以解釋MAGEA4、EB1免疫組織化學(xué)反應(yīng)性。如下，染色強(qiáng)度：0=無染色，1=灰色，2=黃色，3=棕色；陽性區(qū)域：0表示≤5%，1表示6%～25%，2表示26%～50%，3表示51%～75%，4表示>75%。將染色強(qiáng)度和陽性面積的值相乘得到最終得分。0～2為陰性，3～4為弱陽性，6～8為中度陽性，9～12為強(qiáng)陽性。

1.4 隨訪

隨訪方式為電話隨訪，隨訪內(nèi)容為術(shù)后生活質(zhì)量，隨訪開始日期為出院日期，結(jié)束日期為2017年12月31日，總生存期為患者出院至死亡或隨訪截止的時間。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 癌旁組和肺癌組中MAGEA4、EB1 mRNA水平的表達(dá)

肺癌組MAGEA4、EB1 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組(表1)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 癌旁組和肺癌組中EB1、MAGEA4 mRNA水平的表達(dá)

2.2 癌旁組和肺癌組中MAGEA4、EB1的免疫組化表達(dá)評分及陽性率

MAGEA4主要定于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或深棕黃色顆粒，EB1主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒；肺癌組MAGEA4陽性129例，EB1陽性106例，肺癌組MAGEA4、EB1陽性率高于癌旁組(P<0.001)；肺癌組MAGEA4、EB1蛋白表達(dá)評分高于癌旁組(P<0.001)(圖1，表2)。

表2 MAGEA4、EB1在癌旁組、肺癌組中的免疫組化表達(dá)及陽性率

圖1 癌旁組和肺癌組MAGEA4、EB1的表達(dá)Figure 1 Expression of MAGEA4 and EB1 proteins in paracancerous and lung cancer tissuesNote：A.Expression of MAGEA4 protein in adjacent tissues；B.Expression of MAGEA4 protein in lung cancer tissues；C.Expression of EB1 protein in adjacent tissues；D.Expression of EB1 protein in lung cancer tissues.

2.3 MAGEA4、EB1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

MAGEA4、EB1蛋白表達(dá)與年齡、病理學(xué)類型無關(guān)(P>0.05)；與腫瘤最大徑、病理學(xué)分級、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)，且腫瘤最大徑≥5 cm、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，MAGEA4、EB1蛋白陽性表達(dá)率越高(P<0.001)(表3)。

2.4 MAGEA4、EB1表達(dá)水平與肺癌患者預(yù)后分析

隨訪發(fā)現(xiàn)，MAGEA4陰性表達(dá)患者的中位存活時間為72.76個月(95%CI：67.64～87.91個月)，明顯高于MAGEA4陽性表達(dá)患者的51.74個月(95%CI：45.62～65.99個月)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。EB1陰性表達(dá)患者的中位存活時間為74.65個月(95%CI：56.32～89.14個月)，明顯高于EB1陽性表達(dá)患者的49.17個月(95%CI：32.54～59.32個月)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；MAGEA4、EB1陰性組3年生存率高于MAGEA4、EB1陽性組(47.6%vs. 35.4%，60.3%vs. 32.4%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)行Cox回歸分析，回歸模型具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MAGEA4陽性、EB陽性是肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)(圖2，表4)。

表3 MAGEA4、EB1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表4 影響肺癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

圖2 MAGEA4、EB1陽、陰組Kaplan-Meier生存曲線分析Figure 2 Kaplan-Meier survival curves of positive and negative expression of MAGEA4 or EB1 proteins in lung cancer patientsNote：A.The negative expression of MAGEA4 protein；B.The positive expression of MAGEA4 protein；C.The negative expression of EB1 protein；D.The positive expression of EB1 protein.

3 討論

MAGEA4作為Tregs發(fā)育和功能的主要調(diào)節(jié)劑。Tregs是T細(xì)胞亞群，具有免疫抑制功能，可防止身體對自身抗原反應(yīng)過度。因此，這些細(xì)胞在自身耐受中起關(guān)鍵作用[11-12]。此外，Tregs參與腫瘤逃離免疫系統(tǒng)?；加腥橄侔?、胃癌、肝癌和一些其他癌癥的患者的外周血和腫瘤組織中MAGEA4+Tregs的數(shù)量增加。在之前的研究中，MAGEA4+Tregs的數(shù)量已顯示與腫瘤進(jìn)展和肺癌患者預(yù)后密切相關(guān)。最近的研究報道，MAGEA4不僅在Tregs中表達(dá)，而且還在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，不同腫瘤細(xì)胞中的MAGEA4表達(dá)可以起到不同的作用[13]。人胰腺癌高表達(dá)MAGEA4，39個樣本中有24例表達(dá)MAGEA4(61%陽性率)。此外，MAGEA4在胰腺癌中的表達(dá)可抑制T細(xì)胞增殖；使用免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中MAGEA4表達(dá)增加(57%陽性率)，MAGEA4表達(dá)與無復(fù)發(fā)和總存活率下降密切相關(guān)；前列腺癌細(xì)胞中MAGEA4表達(dá)升高[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌組MAGEA4 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組；肺癌組MAGEA4陽性率、蛋白表達(dá)高于癌旁組；MAGEA4蛋白表達(dá)與腫瘤最大徑、病理學(xué)分級、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有相關(guān)性，且腫瘤最大徑≥5 cm、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)時，MAGEA4、EB1蛋白陽性表達(dá)率越高。這與上述討論符合，同時也提示，MAGEA4蛋白在肺癌組織中高表達(dá)，其能促進(jìn)肺癌的進(jìn)展。細(xì)胞分子學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，外源性MAGEA4在肝癌細(xì)胞核中積累，抑制Caspase介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡，并使肝癌細(xì)胞對化學(xué)治療劑敏感性降低，意味著MAGEA4是腫瘤促進(jìn)因子，MAGEA4由蛋白酶體加工以產(chǎn)生抑制凋亡的C末端片段，其最終降低p53活性，從而抑制細(xì)胞凋亡。

EB1在微管動力學(xué)、細(xì)胞極性和基因組穩(wěn)定性中的生理作用已被大量研究。然而，EB1控制腫瘤發(fā)生和腫瘤細(xì)胞生長的分子途徑才剛剛開始起步。蛋白質(zhì)組學(xué)分析將EB1鑒定為喉癌細(xì)胞中的放射抗性相關(guān)基因。研究表明[15]，EB1是乳腺癌細(xì)胞通過誘導(dǎo)GTSE1(G-2和S期表達(dá)1)激活而增加侵襲能力所必需的。EB1功能主要歸因于與APC的復(fù)合物形成，并且隨后通過抑制APC和β-連環(huán)蛋白之間的直接相互作用誘導(dǎo)β-連環(huán)蛋白的核積累。由此產(chǎn)生的β-連環(huán)蛋白的增加增強(qiáng)了T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(Tcf/Lef)的轉(zhuǎn)錄活性。已經(jīng)確定Wnt/β-catenin途徑通過促進(jìn)β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的Tcf/Lef靶基因(例如細(xì)胞周期蛋白D1和c-Myc)的表達(dá)來調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和癌細(xì)胞的惡性表型[16]。因此，EB1對β-連環(huán)蛋白動力學(xué)的影響支持EB1是致癌基因的可能性，盡管與細(xì)胞生長和腫瘤發(fā)展的調(diào)節(jié)相關(guān)的信號傳導(dǎo)機(jī)制仍有待闡明。近期研究顯示EB1在免疫細(xì)胞上表達(dá)并介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫[17]。近年來，已顯示EB1在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)；然而，與免疫細(xì)胞中功能相反，它起著負(fù)面作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌組MAGEA4、EB1mRNA表達(dá)水平高于癌旁組；肺癌組MAGEA4、EB1陽性率、蛋白表達(dá)高于癌旁組。這與上述討論相符。相關(guān)研究顯示EB1活化釋放炎性細(xì)胞因子和免疫抑制因子以誘導(dǎo)免疫耐受并促進(jìn)腫瘤逃逸。結(jié)直腸癌和胰腺導(dǎo)管腺癌中已顯示EB1表達(dá)增加，并且EB1表達(dá)與腫瘤進(jìn)展之間存在密切關(guān)系。動物研究表明[18]，攜帶S180骨肉瘤小鼠早期EB1的表達(dá)明顯高于晚期骨肉瘤。此外，EB1刺激后培養(yǎng)的S180骨肉瘤細(xì)胞中IL-10和TGF-β(兩種重要的免疫抑制因子)的表達(dá)上調(diào)。本研究同時發(fā)現(xiàn)，MAGEA4、EB1蛋白表達(dá)與腫瘤最大徑、病理學(xué)分級、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有相關(guān)性，且腫瘤最大徑≥5 cm、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)時MAGEA4、EB1蛋白陽性表達(dá)率越高。提示MAGEA4和EB1蛋白在肺癌組織中高表達(dá)，其能促進(jìn)肺癌的進(jìn)展。

此外，本研究也發(fā)現(xiàn)MAGEA4、EB1陰性表達(dá)患者的平均存活時間高于MAGEA4、EB1陽性表達(dá)患者；MAGEA4、EB1陰性組3年生存率高于MAGEA4、EB1陽性組；淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移MAGEA4陽性、EB1陽性是肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素，說明MAGEA4、EB1蛋白低表達(dá)的肺癌患者能獲得較好的預(yù)后。

綜上所述，MAGEA4和EB1蛋白在肺癌組織中陽性表達(dá)率增高，其高表達(dá)可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)；MAGEA4、EB1蛋白陰性表達(dá)的肺癌患者能獲得較好的預(yù)后。