安巍巍 唐雅莉 趙蓮花 楊 悅 王新玲

近年來，腫瘤的發(fā)病率明顯增高，而乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1-3]。在目前臨床中，局部的手術范圍日趨保守，化療、放療等綜合治療的有效性使得乳腺癌的長期生存率不斷提高，但總生存率仍然不理想。因此，進一步研發(fā)乳腺癌的治療方法和開發(fā)新的治療方案仍然任重道遠。

紅松(Pinus Koraiensis Sieb.et Zucc)為我國東北的鄉(xiāng)土樹種。由于紅松松塔沒有可以入藥的記載，國內對紅松松塔還缺乏系統(tǒng)的藥理活性研究。國外的研究證明松塔提取物多聚苯丙素-多糖復合物(Polyphenylpropenoid-polysaccharide complex，PPC)可激活人體內的免疫細胞，尤其是樹突狀細胞，發(fā)揮增強人體自身免疫力的作用[4-5]，而且在研究中發(fā)現不同種屬松塔的提取物均可發(fā)揮相似的作用。我們前期的研究也證明紅松松塔的提取物可抑制S180荷瘤小鼠的腫瘤生長[6]。本研究以乳腺癌細胞MCF-7為研究對象，考察PPC誘導細胞凋亡的機制，為PPC的進一步開發(fā)和利用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株MCF-7購自黑龍江省腫瘤防治研究所；紅松松塔采自黑龍江省伊春市；MTT和Hoechst 33258購自碧云天生物公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司；α-MEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；Cell death detection kit購自美國Roche公司；Caspase-3 Colorimetric Assay和Caspase-9 Colorimetric Assay購自美國Millipore公司；Caspase-3多克隆抗兔抗體購自美國Cell signaling公司；Caspase-3抑制劑(z-DEVE-fmk)購自美國Calbiochem公司；辣根過氧化酶標記的養(yǎng)抗兔二抗購自碧云天生物公司。其他常用試劑均為分子生物學實驗適用級別試劑。

1.2 方法

1.2.1 紅松松塔PPC的制備 按文獻報道進行制備。簡述如下：紅松松塔簡單分解后進行清洗，干燥，粉碎。將粉末與0.1 m NaOH按固液比1∶5混合，加壓提取2 h，過濾除去固體粉末，濾液以10 000 rpm離心15 min，取上清，調節(jié)pH7.0，過濾除菌，PPC濃度以μg/mL表示。

1.2.2 細胞培養(yǎng) MCF-7細胞接種在含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液中，在飽和濕度，溫度為37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天傳代。

1.2.3 MCF-7細胞生長抑制實驗[7]取處于對數生長期的細胞，調整密度為5×104個細胞/mL，以每孔100 μL接種于96孔板。接種的同時加入PPC終濃度50、100、150和200 μg/mL。然后在培養(yǎng)24、48、72和96 h后，使用MTT法測定吸光度值，計算生長抑制率(以0時間或未處理細胞作為對照)。

1.2.4 細胞核熒光染色[8]取處于對數生長期的細胞，調整密度為5×104個細胞/mL，使用PPC處理細胞后48 h，收集細胞，1 000 rpm離心5 min，用PBS洗2次，以100 μL 4%的多聚甲醛重懸細胞，4℃固定1 h，1000 rpm離心3 min，棄上清，用PBS洗1次。使用10 μL PBS重懸細胞，加入Hoechst 33258，終濃度167 μM，37℃孵育10 min后，置于載玻片上，封片，熒光顯微鏡下觀察，并拍照。

1.2.5 DNA片段化分析測定細胞凋亡 取處于對數生長期的細胞，調整密度為5×104個細胞/mL，使用PPC處理細胞后48 h，收集細胞，1 000 rpm離心5 min，用PBS洗2次，按文獻方法提取DNA[9]：加入100 μL細胞裂解液(10 mM Tris-HCl pH 7.4，10 mM EDTA pH 8.0，0.5%Triton X-100)4℃裂解30 min，25 000×g離心20 min，收集上清液。加入40 ng.L-1Nase A，37℃孵育1 h，再加入40 ng.L-1proteinase K，37℃孵育2 h，加入20 μL 5M NaCl和120 μL異丙醇，-20℃過夜。25 000×g離心20 min，收集沉淀，以Tris-EDTA緩沖液(pH7.5)溶解。提出的DNA用2%瓊脂糖凝膠在100 V下電泳1 h，以0.5 μg.mL-1溴化乙錠染色20 min，以蒸餾水洗10 min，使用凝膠自動成像拍照。

1.2.6 細胞凋亡檢測 取處于對數生長期的細胞，調整密度為5×104個細胞/mL，在有和無z-DEVE-fmk(20 μM)條件下使用PPC處理細胞后24、48和72 h，按說明書所述進行細胞凋亡檢測。

1.2.7 Caspase-3和Caspase-9酶活力檢測 取處于對數生長期的細胞，調整密度為5×104個細胞/mL，在使用PPC(終濃度50、100和200 μg/mL)處理細胞48 h后，收集細胞。按試劑盒方法進行酶活力檢測。

1.2.8 Caspase-3蛋白表達分析[10]取處于對數生長期的細胞，調整密度為5×104個細胞/mL，在有和無z-DEVE-fmk(20 μM)條件下使用PPC(終濃度50、100和200 μg/mL)處理細胞48 h后，收集細胞，按常規(guī)方法裂解細胞，測定蛋白濃度，以30 μg蛋白上樣后，進行SDS-聚丙烯酰胺電泳，分離蛋白。轉移到NC膜后，封閉、加入一抗和二抗后，使用ECL增強化學發(fā)光方法顯色。

1.3 統(tǒng)計學處理

數據分析采用SPSS 17.0軟件，不同時間重復測量資料的差異分析采用重復測量方差分析。采用t檢驗和方差分析比較連續(xù)性變量在各組中的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PPC對MCF-7細胞的生長抑制作用

不同濃度的PPC處理細胞不同時間后使用MTT法檢測細胞抑制率。重復測量方差分析結果顯示時間和濃度分組的交互作用無統(tǒng)計學意義(P=0.351)，說明時間因素的作用不隨著濃度分組的不同而不同。48 h處理時間的抑制率顯著高于24 h；不同濃度兩兩比較，除25 μg/mL與50 μg/mL濃度無差別外，其余比較均可見差別。使用不同濃度、不同時間的抑制率作圖，可見濃度100 μg/mL(不同時間)或時間48 h(不同濃度)的結果穩(wěn)定(圖1)。因此，本研究選擇48 h處理時間點及100 μg/mL進行后續(xù)實驗。

2.2 PPC誘導MCF-7細胞凋亡

PPC(100 μg/mL)處理細胞后，使用細胞凋亡試劑盒檢測吸光度值。重復測量數據方差分析結果顯示時間因素有統(tǒng)計學意義(F=64.75，P=0.014)；不同時間兩兩比較結果顯示，除48 h與72 h無統(tǒng)計學差異，其余均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，即吸光度(凋亡比例)隨時間延長而增加，說明PPC可誘導細胞時間依賴性凋亡(圖2A)；DNA Ladder結果可見典型的細胞凋亡后DNA斷裂形成的條帶(圖2B)；Hoechst 33258染色表明，正常細胞全部藍染，細胞壁完整(圖2C)，而PPC處理MCF-7細胞后，細胞核破碎后形成凋亡小體，即形成小的致密藍染(箭頭所示)，是細胞發(fā)生凋亡的典型形態(tài)(圖2D)。

2.3 Caspase-3和Caspase-9酶活力增加

PPC(100 μg/mL)處理細胞48 h后，使用Caspase activity detection kit檢測Caspase-3和Caspase-9酶活力(n=3)。結果可見PPC處理后MCF-7細胞的Caspase-3和Caspase-9酶活力有增加趨勢，但無統(tǒng)計學差異，可能是由于樣本量較小(圖3)。

2.4 Caspse-3前體酶蛋白表達減少

PPC(100 μg/mL)處理MCF-7細胞不同時間后，蛋白質電泳的結果可見Caspase-3前體酶的蛋白表達降低(P<0.05)，說明PPC處理后Caspase-3酶活化(圖4)。

圖1 PPC對MCF-7細胞的生長抑制作用Figure 1 Inhibitory effect of PPC on proliferation of MCF-7 cells

圖3 PPC處理后細胞中caspase-3和caspase-9的酶活力Figure 3 Activities of caspase-3 and-9 in MCF-7 cells treated with PPC

圖4 PPC處理后對Caspase-3前體酶蛋白表達的影響Figure 4 Effect of PPC on the expression of pro-caspase-3 protein in MCF-7 cells

圖2 PPC處理后MCF-7細胞生長抑制的作用模式(凋亡)Figure 2 Apoptosis of MCF-7 cells induced by PPCNote：A.Cell apoptosis was detected by a cell death detection kit；B.DNA fragmentation；C.Control cells；D.Nuclear staining with Hoechst33258(cells treated with 100 μg/mL of PPC for 48 h).

2.5 Caspse-3抑制劑部分抑制細胞凋亡

在有和無z-DEVE-fmk(20 μM)條件下使用PPC(100 μg/mL)處理MCF-7細胞48 h后，細胞凋亡檢測可見細胞凋亡被部分抑制；蛋白質電泳的結果可見，PPC處理細胞Caspase-3前體酶的蛋白表達降低(P<0.05)，而z-DEVE-fmk和PPC同時處理細胞時Caspase-3前體酶的蛋白表達恢復，進一步證明PPC處理后Caspase-3酶的活化(圖5)。

圖5 Caspase-3抑制劑z-DEVE-fmk對PPC處理誘導的細胞凋亡和Caspase-3前體酶蛋白表達的影響Figure 5 Effect of caspase-3 inhibitor(z-DEVE-fmk)on PCC-induced apoptosis and expression of pro-caspase-3 protein in MCF-7 cellsNote：A.Cell apoptosis was detected by a cell death detection kit；B.The expression of pro-caspase-3 protein was detected by Western blot.Con.Control；1.z-DWVE-fmk；2.PPC；3.PPC+ z-DWVE-fmk；*P<0.05，compared with the control group.

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與腫瘤細胞的惡性增殖和凋亡有關。隨著對細胞凋亡研究的深入，現已證明細胞凋亡受阻可能是腫瘤發(fā)病機制之一，這就使采用新的藥物誘導細胞凋亡來治療這一疾病成為一種可行的辦法[11-13]。細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身程序，由基因控制的細胞自主性死亡過程，具有獨特的形態(tài)和生化特征。

基于文獻報道和我們的研究結果，我們考察了PPC對乳腺癌細胞MCF-7的細胞毒作用及其作用機制。研究發(fā)現，PPC可抑制MCF-7細胞的生長，且有濃度和時間依賴性。細胞形態(tài)學的變化是判斷細胞發(fā)生凋亡的最直觀方法[14]。Hoechst 33258熒光染色法顯示PPC處理的MCF-7細胞可見核濃縮的強藍色熒光團塊及細胞皺縮、核碎裂、凋亡小體等凋亡形態(tài)學改變，而對照細胞則顯示為全部藍染。DNA ladder的形成與細胞凋亡密不可分，同時也是判斷細胞凋亡的重要標準之一[15]。PPC作用于MCF-7細胞后，在瓊脂糖凝膠電泳上產生核酸片段條帶。以上研究結果提示，PPC可誘導MCF-7細胞凋亡。

盡管凋亡的分子機制還不完全清楚，但已認識到凋亡過程受相關蛋白的調節(jié)和控制[16]。Caspase在細胞凋亡過程中起著主導作用[17]，其中，Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路，在細胞凋亡過程中居中心地位；而Caspase-9是線粒體凋亡途徑的重要“啟動者”[20]。本研究結果表明，PPC誘導MCF-7細胞凋亡時Caspase-3和Caspase-9的酶活力升高，Caspase-3前體酶蛋白表達下降，即表示Caspase-3酶發(fā)生活化，而且Caspase-3抑制劑z-DEVE-fmk可部分抑制PPC誘導的MCF-7細胞凋亡，并可恢復Caspase-3前體酶蛋白表達。因此PPC可能通過激活Caspase家族誘導MCF-7細胞凋亡。以上研究結果表明PPC可能具有潛在的乳腺癌治療作用，但仍需要對包括體內抑瘤作用等方面進一步研究。