王德寶 趙麗華 田建軍 趙富元 呂金積 張海榮 靳 燁*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 內(nèi)蒙古呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古蒙元寬食品有限公司 內(nèi)蒙古古巴彥淖爾015000 3 內(nèi)蒙古晶鑫食品有限公司 內(nèi)蒙古古巴彥淖爾015000）

發(fā)酵香腸在市場上占有份額較少，因其呈現(xiàn)出誘人的玫瑰色、獨(dú)特的風(fēng)味而深受消費(fèi)者的青睞，然而其食品安全問題也備受關(guān)注。發(fā)酵香腸是指將絞碎的瘦肉與丁狀脂肪及輔料混勻后灌入腸衣，經(jīng)自然或添加外源發(fā)酵劑發(fā)酵、干燥成熟制成pH 值低于安全酸度5.3 的一類發(fā)酵肉制品[1-3]。pH、風(fēng)味物質(zhì)等變化離不開糖類、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分解氧化[4]。封麗[5]、陳肖等[6]研究了腌制劑、脂肪酶中式香腸風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的貢獻(xiàn)作用。Toldra等[7]研究發(fā)現(xiàn)干腌火腿中絕大部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)因脂類而自動氧化形成。蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生游離氨基酸經(jīng)脫羧、脫氨或羰基等作用，可產(chǎn)生一系列具有良好嗅感的物質(zhì)[8]。游離氨基酸也是生物胺類物質(zhì)主要前體，SILLA[9]研究表明少量生物胺對人體具有重要功能和生理調(diào)控，若體內(nèi)積累過量則會導(dǎo)致機(jī)體不適，嚴(yán)重會危及生命。Armagan[10]研究發(fā)現(xiàn)過量生物胺與肉制品中殘留亞硝酸鹽易形成具有強(qiáng)致癌作用的亞硝胺物質(zhì)。良好的風(fēng)味不僅可賦予香腸良好品質(zhì)，也可增加消費(fèi)者購買欲望。同時肉制品食用安全性也引起廣泛關(guān)注。提高香腸良好風(fēng)味物質(zhì)含量及控制香腸有害生物胺含量尤為重要。本試驗(yàn)通過添加植物乳桿菌與肉葡萄球菌發(fā)酵劑，探究在發(fā)酵香腸加工過程，發(fā)酵劑對風(fēng)味物質(zhì)釋放及有害生物胺控制的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料肉（m原料肉∶m羊肉，肥瘦比為1∶4），源自內(nèi)蒙古巴彥淖爾烏拉特蘇尼特羊后腿及羊尾。腸衣：25～30 mm 羊小腸。

發(fā)酵劑：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）與肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus），由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

主要藥品：硝酸鈉、亞硝酸鈉（分析純），上海國藥集團(tuán)；單磺酰氯、組胺、β-苯乙胺、酪胺、尸胺和1，7-二氨基庚烷（色譜級），美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、正己烷及丙酮（色譜級），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

主要儀器與設(shè)備：1260 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；HD-3A 型智能水分活度測量儀，深圳市銀都科技有限公司；TCP2 全自動測色色差計(jì)，北京奧依克光電儀器；Master DHS 動態(tài)頂空進(jìn)樣器，美國Thermo 科技有限公司；GC-MS DSQ II 單四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo 公司；TG16-WS 臺式高速離心機(jī)，湖南離心機(jī)儀器有限公司；LRH-250-HS 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，沈陽亮衡天平儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵香腸工藝配方[3]配方：羊后腿肉80%、羊尾肥膘20%、蔗糖0.5%、食鹽2.5%、亞硝酸鈉70 mg/kg、葡萄糖0.5%、硝酸鈉100 mg/kg、抗壞血酸0.05%、發(fā)酵劑107CFU/g。

發(fā)酵香腸加工條件見表1。

表1 發(fā)酵香腸加工條件Table 1 The processing conditions of fermented sausage

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過預(yù)試驗(yàn)及單因素模擬試驗(yàn)，獲得發(fā)酵劑植物乳桿菌與肉葡萄球菌最佳復(fù)配比1∶2。試驗(yàn)共分3 組：第1 組為對照組（不加外源發(fā)酵劑），第2 組為單一植物乳桿菌，第3 組為植物乳桿菌和肉葡萄球菌復(fù)配發(fā)酵劑。樣品分別于灌腸后（0）、發(fā)酵結(jié)束（3 d）、干燥中期（6 d）、成熟（9 d）4 個工藝點(diǎn)各隨機(jī)抽取，并測定其理化品質(zhì)。

1.2.3 理化指標(biāo)測定 參照GB/T 9695.5-2008《肉與肉制品pH 測定》、GB 5009.33-2010 《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》、GB/T5009.208-2008《食品中生物胺含量測定》測定香腸pH、亞硝酸鹽及生物胺含量[11-13]；使用HD-3A 型智能水分活度儀測定Aw。

1.2.4 風(fēng)味測定[14]氣相色譜GC 條件：色譜柱為TR-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。升溫程序：初始溫度35 ℃，保持2 min；以4 ℃/min 升至160 ℃，保持2 min；再以10 ℃/min 升至240 ℃，保持10 min。質(zhì)譜條件：接口溫度250 ℃，離子源溫度250 ℃，電子方式為EI，溶劑延長時間3 min，離子掃描范圍50～300 amu。DHS：保溫3 min，爐溫75 ℃，剝離時間8 min，流速40 mL/min；干燥時間1 min，流速30 mL/min；注射時間3 min，接口處溫度250 ℃，焙烤時間20 min，流速80 mL/min，傳送帶溫度200 ℃，轉(zhuǎn)化閥200 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 和SPSS19.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著，同組不同制作時間差異性用大寫字母表示，同一時間不同組間差異用小寫字母表示，相同字母表示不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸品質(zhì)影響

2.1.1 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸pH 的影響 由圖1可知，灌腸后0 d，3 組發(fā)酵香腸pH 值均為5.8，與新鮮原料肉酸度值相差甚微，說明在腌制過程中菌株生長活性微小，幾乎無酸產(chǎn)生。發(fā)酵過程，發(fā)酵劑通過糖酵解將碳水化合物快速分解為乳酸等小分子有機(jī)酸[15]，促使香腸pH 急劇下降；3 d 發(fā)酵結(jié)束，復(fù)配組pH（5.07）＜單一組pH（5.13）＜對照組pH（5.22）（P＜0.05）。3～6 d 干燥過程，香腸所處環(huán)境溫度、RH 急劇降為15 ℃、80%～85%，發(fā)酵劑代謝活性及產(chǎn)酸能力可能受到抑制，使pH 下降速率減緩，干燥結(jié)束復(fù)配組pH（4.74）降到組中最低，說明添加復(fù)配發(fā)酵劑可加快香腸產(chǎn)酸速率。6～9 d，隨著產(chǎn)酸速率下降及香腸中水分和酸性物不斷揮發(fā)，蛋白可能被分解產(chǎn)生堿性物質(zhì)，含量增加[16-17]，使香腸pH 在成熟過程中呈上升趨勢。發(fā)酵結(jié)束，復(fù)配組香腸pH（4.94）顯著低于發(fā)酵香腸安全酸度（5.3）（P＜0.05）[18]。

2.1.2 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸水分活度（Aw）的影響 水分活度（Aw）已成為衡量食品保藏期長短的一個重要指標(biāo)，可以說Aw 是控制食品腐敗的重要因素。Aw＜0.9 時，大部分細(xì)菌生長受到抑制；Aw＜0.6 時，霉菌及耐鹽細(xì)菌代謝活性幾乎為零。從酶與Aw 關(guān)系來看，Aw 高、低影響酶促反應(yīng)底物濃度及酶構(gòu)象，Aw＜0.85 時，酶活性大幅下降[19-20]。

由圖2可知，0 d，3 組發(fā)酵香腸Aw 值均為0.97。0～3 d 發(fā)酵過程，高濕條件（RH：90%～95%）幾乎抑制香腸中水分向外擴(kuò)散的可能性，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵香腸Aw 仍為0.97。3～6 d 干燥期，因香腸內(nèi)外環(huán)境溫度和RH 差，促使水分逐漸向外部環(huán)境擴(kuò)散，結(jié)束時3 組Aw 分別降為0.86，0.85，0.83，且復(fù)配組Aw 值＜單一組＜對照組，表明發(fā)酵劑有助于香腸Aw 的降低。6～9 d 成熟過程，3 組香腸Aw 值持續(xù)下降，相比干燥過程，下降幅度較小，可能是由于香腸肉餡外層水分?jǐn)U散速率快于內(nèi)層，導(dǎo)致外層較為干燥，阻礙了肉餡中心水分的散發(fā)；香腸發(fā)酵結(jié)束，3 組Aw 值分別降為0.80，0.79 及0.76。

圖1 發(fā)酵羊肉香腸pH 變化Fig.1 pH changes of the fermented mutton sausages

圖2 發(fā)酵羊肉香腸Aw 變化Fig.2 Changes of Aw value of the fermented mutton sausages

2.1.3 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中亞硝酸鹽的影響 亞硝酸鹽具有發(fā)色、抗氧化及防腐作用，可消除原料肉不適風(fēng)味，提高產(chǎn)品質(zhì)量[21]。然而其殘留過量會與香腸中生物胺生成具有強(qiáng)致癌作用的亞硝胺，是目前食品界備受關(guān)注的食品安全問題[22]。

由圖3可知，0 d 時3 組亞硝酸鹽含量均為70 mg/kg。0～3 d 發(fā)酵過程，低pH 值使部分亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸，與肌紅蛋白結(jié)合生成亞硝基肌紅蛋白[23-24]，香腸中亞硝酸鹽殘留量呈下降趨勢，3d 末復(fù)配組亞硝酸鹽含量（66 mg/kg）＜單一組（68 mg/kg）＜對照組（69 mg/kg）（P＜0.05）。干燥過程環(huán)境溫度及RH 急劇降低，使硝酸還原酶活性被抑制，3 組發(fā)酵香腸亞硝酸鹽含量急劇下降，對照組、單一組及復(fù)配組3 組含量分別為16.8，15.2，13.5 mg/kg，且3 組間差異顯著（P＜0.05）。成熟結(jié)束即為成品，復(fù)配組亞硝酸鹽殘留量（12.6 mg/kg）顯著低于其它兩組，更低于國家食品安全規(guī)定最高允許殘留量30 mg/kg[25]。

2.2 發(fā)酵香腸中生物胺

2.2.1 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中β-苯乙胺含量的影響 苯乙胺是一種芳香胺，可被單胺酶氧化分解，可有效防止其在腦部集中。Bover-cid[26]研究發(fā)現(xiàn)，精胺與亞精胺是香腸原料肉中最主要的生物胺。朱志遠(yuǎn)等[27]試驗(yàn)表明，發(fā)酵劑和成熟時間對精胺和亞精胺含量基本沒有影響。本試驗(yàn)主要探究不同發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸制作過程（發(fā)酵、干燥及成熟過程）有害生物胺的抑制作用。

由圖4可知，發(fā)酵結(jié)束時復(fù)配組β-苯乙胺含量（2.81 mg/kg）＜單一組（3.83 mg/kg）＜對照組（6.89 mg/kg），且組間含量差異顯著（P＜0.05）。3～6 d 干燥過程，各組β-苯乙胺含量呈下降趨勢，對照組下降幅度最大，此時內(nèi)源酶對苯乙胺分解作用大于外源酶。6～9 d 成熟過程，較低溫度及濕度對香腸中微生物及酶代謝活性均產(chǎn)生較強(qiáng)抑制作用，β-苯乙胺呈上升趨勢，其中添加發(fā)酵劑兩組苯乙胺含量增加幅度高于對照組。

圖3 發(fā)酵羊肉香腸中亞硝酸鹽含量變化Fig.3 Changes of the nitrite content of the fermented mutton sausages

2.2.2 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中尸胺含量的影響尸胺雖對人體無害，但可通過抑制雙胺氧化酶、羥甲基轉(zhuǎn)化酶及脫毒酶的活性而潛在增加組胺含量及毒性[28]。

由圖5可知，3 d 發(fā)酵結(jié)束時3 組尸胺的含量較高，且對照組（9.85 mg/kg）顯著高于復(fù)配組（8.53 mg/kg）與單一組（8.40 mg/kg）（P＜0.05），單一組與復(fù)配組間尸胺含量差異不明顯（P＞0.05）。干燥過程中，各組尸胺含量呈下降趨勢，干燥結(jié)束時結(jié)果與發(fā)酵結(jié)束差異顯著（P＜0.05）。6～9 d，3組尸胺含量大幅下降，復(fù)配組含量（4.02 mg/kg）＜單一組（4.10 mg/kg）＜對照組（4.65 mg/kg），說明通過發(fā)酵、成熟及添加植物乳桿菌與肉葡萄球菌復(fù)配發(fā)酵劑能有效較低香腸中尸胺含量。

2.2.3 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中組胺含量的影響組胺是組氨酸經(jīng)脫羧酶脫羧后形成，是食品中毒性最強(qiáng)的胺。其毒性效果取決于組胺的吸收濃度以及其它胺的存在情況，甚至還包括胺氧化酶的活性以及個人腸內(nèi)的生理狀況。美國食品藥品管理局 （FDA） 規(guī)定食品中組胺含量＜50 mg/kg，酪胺＜100 mg/kg。歐洲在魚產(chǎn)品中規(guī)定組胺最高限量為100 mg/kg[30]。由表2可知，香腸加工前期3組香腸均未檢出組胺。成熟末期，對照組組胺含量為3.036 mg/kg，單一組為2.92 mg/kg，復(fù)配組為2.89 mg/kg，復(fù)配組＜單一組＜對照組。綜上表明，添加復(fù)合發(fā)酵劑有助于降低香腸中有害生物胺殘留。

圖4 發(fā)酵羊肉香腸中β-苯乙胺含量變化Fig.4 The content changes of β-phenylethylamine in fermented mutton sausages

圖5 發(fā)酵羊肉香腸中尸胺含量變化Fig.5 The content change of cadaverine in fermented mutton sausages

表2 發(fā)酵羊肉香腸中組胺含量變化Table 2 The content changes of histamine in fermented mutton sausages

圖6 發(fā)酵羊肉香腸中酪胺含量變化Fig.6 The content changes of tyramine in fermented mutton sausages

2.2.4 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中酪胺含量的影響由圖6可知，發(fā)酵結(jié)束時3 組香腸酪胺含量較低，結(jié)果為對照組（6.32 mg/kg）＞單一組（2.42 mg/kg）＞復(fù)配組（2.11 mg/kg）。3～6 d 干燥過程，酪胺含量呈快速上升趨勢，干燥結(jié)束時酪胺含量顯著高于發(fā)酵結(jié)束時（P＜0.05），組間仍是對照組（15.48 mg/kg）＞單一組 （12.54 mg/kg）＞復(fù)配組 （8.07 mg/kg）。在6～9 d 成熟過程，各組酪胺含量是干燥結(jié)束時的2～3 倍，而復(fù)配組含量（22.54 mg/kg）顯著低于其它兩組。綜上表明，苯乙胺與酪胺同時產(chǎn)生，且酪胺在香腸中呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，而成熟結(jié)束各組含量均低于100 mg/kg；相比對照和單一組，復(fù)合發(fā)酵劑對酪胺含量變化有一定的抑制作用。綜觀整體，在香腸制作各階段點(diǎn)，成品時酪胺含量最高，與張慧超等[29]研究結(jié)果一致。

2.3 香腸中風(fēng)味物質(zhì)

香腸中風(fēng)味物質(zhì)主要源于三大營養(yǎng)物質(zhì)分解及生化反應(yīng)。碳水化合物在發(fā)酵劑作用下被分解產(chǎn)生乳酸、乙酸、琥珀酸等，可賦予香腸特殊風(fēng)味物質(zhì)；糖與蛋白質(zhì)經(jīng)過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生呋喃、吡啶、吡嗪、噻吩、噻唑、吡咯、咪唑以及環(huán)烯硫化物，是香腸產(chǎn)生肉香味主要途徑[31]。此外，肉中豐富的不飽和脂肪酸易被氧化分解產(chǎn)生酮、醛及內(nèi)酯等對香腸香味具有重要貢獻(xiàn)的風(fēng)味物質(zhì)[8]。風(fēng)味是評價肉制品品質(zhì)特征的重要因素，良好的風(fēng)味不僅可賦予香腸良好品質(zhì)，也可增加消費(fèi)者購買欲望。

表3 發(fā)酵羊肉香腸中風(fēng)味物質(zhì)相對含量Table 3 Relative contents of volatile flavor compounds in fermented mutton sausages

由表3可知，通過添加植物乳桿菌與肉葡萄球菌制作發(fā)酵香腸，在香腸成熟結(jié)束即為成品時共鑒定出26 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要包括醇類5種，醛類4 種，酯8 種，酸類3 種，烴類5 種及醚類1 種。從對照組共檢出15 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醇類1 種，醛類2 種，酯6 種，酸類1 種，烴類4 種及醚類1，而單一組與復(fù)配組均檢出26 中風(fēng)味物質(zhì)。比較3 組6 類風(fēng)味物質(zhì)相對含量，可知含量最為豐富是醇類，醛類次之，其次是酯類、烴類，而醚類含量最低。結(jié)果表明：復(fù)配組醇類風(fēng)味物質(zhì)含量8.90 mg/kg，單一組為8.66 mg/kg，顯著高于對照組1.27 mg/kg；復(fù)配組與單一組醛類物質(zhì)含量分別為8.04，6.24 mg/kg，遠(yuǎn)高于對照組0.40 mg/kg。對于酯類、烴類、酸類等風(fēng)味物質(zhì)，兩發(fā)酵劑組仍高于對照組。這一結(jié)果可能與接種發(fā)酵劑有關(guān)，產(chǎn)生機(jī)理有待進(jìn)一步研究。綜上可知，醇類、醛類是香腸中主要風(fēng)味貢獻(xiàn)物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

通過添加植物乳桿菌與肉葡萄球菌發(fā)酵劑將試驗(yàn)分為3 組，探究不同發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸加工過程品質(zhì)變化、風(fēng)味物質(zhì)釋放及有害生物胺控制的影響。發(fā)酵過程復(fù)配組產(chǎn)酸速率＞單一組＞對照組，且在干燥結(jié)束時降到組中最低4.74，低于發(fā)酵香腸安全酸度5.3（P＜0.05）；隨著pH 降低，使蛋白質(zhì)對水分束縛能力下降，促使復(fù)配組Aw 下降速率快于其它兩組；低pH 可使亞硝酸鹽與肌紅蛋白間接結(jié)合，生成促進(jìn)香腸顯色的亞硝基肌紅蛋白，并抑制硝酸鹽還原酶活性，成品時復(fù)配組亞硝酸鹽12.6 mg/kg，低于單一和對照兩組，更低于國家安全規(guī)定30 mg/kg[25]。

精胺和亞精胺在香腸制作過程含量變化微小，且為肉中所固有胺類物質(zhì)，未對其加以分析[27]。成品時對照組β-苯乙胺含量＜復(fù)配組＜單一組，復(fù)配組尸胺含量 （4.02 mg/kg）＜單一組（4.10 mg/kg）＜對照組（4.65 mg/kg），組胺僅在9 d 成品時檢出，且復(fù)配組（2.89 mg/kg）＜單一組（2.92 mg/kg）＜對照組（3.036 mg/kg），相比4 種生物胺，酪胺含量最高，整個過程酪胺含量呈上升趨勢，始終為復(fù)配組含量＜單一組＜對照組，其存在有助于增強(qiáng)組胺毒性[31]，說明添加復(fù)配發(fā)酵劑有利于抑制毒性最強(qiáng)組胺和酪胺的釋放，提高香腸安全性。成品時測的發(fā)酵組風(fēng)味物質(zhì)26 種，對照組僅檢出15 種，且發(fā)酵組風(fēng)味物質(zhì)含量顯著高于對照組（P＜0.01），說明添加發(fā)酵劑有助于香腸中風(fēng)味物質(zhì)釋放。

綜上可知，添加復(fù)配發(fā)酵劑不僅有利于縮短香腸發(fā)酵周期，快速降低水分含量，還有助于抑制和降低香腸中亞硝酸鹽及有害生物胺含量，提高香腸安全性和延長貨架期，增加香腸中風(fēng)味物質(zhì)種類及含量。