盧小嵐 王 強(qiáng) 杜 琴 梁 騎 羅文依③ 王舒琪③ 張國(guó)元 劉劍平 王東生

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南充 637000)

核糖體磷蛋白大亞基P0(Ribosomal phospho-protein large P0,RPLP0)蛋白是核糖體大亞基上的一個(gè)重要組成部分，參與蛋白質(zhì)合成過(guò)程的調(diào)節(jié)，對(duì)核糖體的穩(wěn)定和活性起關(guān)鍵作用[1]。此外，RPLP0蛋白還與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、細(xì)胞凋亡、腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2,3]。His6是6個(gè)組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽，能構(gòu)成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征利于純化和檢測(cè)。GST是一種能促進(jìn)蛋白表達(dá)和溶解的標(biāo)簽蛋白。本研究擬采用基于PCR的基因拼裝(PCR based gene assembly)技術(shù)[4]，在RPLP0基因N端引入GST標(biāo)簽，C端引入His6標(biāo)簽，以期獲得具有可溶性易純化性的融合蛋白。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑 PET41a質(zhì)粒購(gòu)自Novagen公司；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 DNA 連接酶、高保真聚合酶和誘導(dǎo)劑IPTG均購(gòu)自日本TaKaRa公司；OverExpress C41(DE3)菌種、DNA ladder、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司；胰蛋白胨和酵母粉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；卡那霉素和氯霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司；引物合成及DNA測(cè)序委托上海生工公司完成；HRP標(biāo)記羊抗小鼠抗體、HRP標(biāo)記羊抗人IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；WB所用重組RPLP0蛋白購(gòu)自Diarect公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象 收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2016年1月～2017年12月期間經(jīng)歐蒙免疫印跡法(LIA)檢出的抗核糖體P蛋白抗體陽(yáng)性患者的血清110例。收集經(jīng)歐蒙免疫印跡法檢測(cè)抗U1-nRNP、SmD1、SS-A、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP-B、PCNA、dsDNA、NUC和AMA M2陽(yáng)性不同自身抗體的血清樣本各6份。

1.2方法

1.2.1PCR擴(kuò)增 根據(jù)Genbank中RPLP0基因編碼序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，并在引物的5′端分別引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位點(diǎn)；引物為：P1：5′-agggatccatgcccagggaagacagg-3′；和P2：5′-agctcgaggtcaaagagaccaaatcccat-3′(下劃線為酶切位點(diǎn))；采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，以Hela細(xì)胞提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μl：2×RT緩沖液4 μl，RT Enzyme Mix 1 μl，Primer Mix 1 μl，RNA 1 μl，ddH2O 13 μl。用cDNA和合成的引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)總體系為50 μl：2×Mix 25 μl，cDNA模板2 μl，特異性引物對(duì)各2 μl (10 μmol/L)，ddH2O 19 μl；擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)熱3 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)后再進(jìn)行72℃延伸 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并切膠回收PCR產(chǎn)物，獲得GST-RPLP0-6*His融合基因片段。

1.2.2質(zhì)粒載體的構(gòu)建及鑒定 采用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ分別對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及PET41a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切；酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠分別回收，再將兩者以T4 DNA連接酶4℃連接過(guò)夜。以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)OverExpress C41(DE3)菌，在LB平板(卡那霉素50 μg/ml，氯霉素34 μg/ml)上進(jìn)行初步篩選，挑取平板上生長(zhǎng)最佳的單個(gè)菌落，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，以BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，同時(shí)對(duì)所提重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.3重組RPLP0蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET41a-GST-RPLP0-6*His轉(zhuǎn)化至OverExpress C41(DE3)菌，挑取單克隆菌落接種入5 ml LB液體培養(yǎng)基(卡那濃度50 μg/ml，氯霉素濃度34 μg/ml)，37℃培養(yǎng)12～14 h。次日以1∶ 100接種，37℃培養(yǎng)至A600 nm達(dá)0.4～0.6 左右，加入濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，20℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，8 000 r/min、4℃離心1 min，收集菌體。加入1 ml破碎液[50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，5 mmol/L EDTA，0.2 mg/ml溶菌酶]進(jìn)行超聲波裂解。裂解條件：冰浴、功率400 W、超聲2 s、間隔6 s、時(shí)間5 min。超聲波裂解后，12 000 r/min、4℃離心1 min，收集上清液(IPTG誘導(dǎo)后裂解上清)和沉淀(IPTG誘導(dǎo)后包涵體)進(jìn)行SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.4重組RPLP0蛋白的純化及復(fù)性

1.2.4.1重組RPLP0蛋白的純化 采用50 ml包涵體洗滌緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，0.5% (v/v) TritonX-100]充分重懸沉淀(IPTG誘導(dǎo)后包涵體)，直至溶液呈均質(zhì)懸濁液。于4℃ 13 000 r/min離心15 min，收集上清(包涵體洗脫液)，將洗滌后的沉淀(IPTG誘導(dǎo)后包涵體)加入適量2 mol/L尿素溶液震蕩溶解，溶解后的懸濁液于4℃ 13 000 r/min離心15 min，收集上清(2 mol/L尿素溶液洗脫液)；未溶解的沉淀加入適量8 mol/L尿素溶液震蕩溶解，溶解后的液體于4℃ 13 000 r/min離心15 min，收集上清(8 mol/L尿素溶液洗脫液)。將收集的包涵體洗脫液、2 mol/L尿素溶液洗脫液和8 mol/L尿素溶液洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析蛋白溶解情況。

1.2.4.2重組RPLP0蛋白的復(fù)性 將8 mol/L尿素溶液洗脫液用8 mol/L尿素溶液稀釋到2 mg/ml，裝入透析袋，透析袋放入復(fù)性緩沖液1(2 mol/L尿素溶液，20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L DTT，0.5 mol/L L-Arginine) (pH8.0)中，常溫透析復(fù)性12 h。然后更換為復(fù)性緩沖液2(20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L DTT)(pH8.0)中，繼續(xù)透析復(fù)性，完全去除尿素。將蛋白溶液從透析袋中取出，離心收集復(fù)性上清液和復(fù)性沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.5重組RPLP0蛋白的免疫原性驗(yàn)證 采用復(fù)性的重組RPLP0蛋白免疫BALB/c雌性小鼠，60 μg/(次·只)，腹腔注射。第一次免疫使用弗氏完全佐劑，第二次和第三次免疫使用弗氏不完全佐劑。第三次免疫后第7天采集小鼠血清，以Diarect公司的重組RPLPO蛋白為上樣蛋白，采用Western blot方法來(lái)檢測(cè)小鼠血清中抗重組RPLPO蛋白抗體。

Diarect公司的重組RPLP0蛋白5、10、20 ng分別上樣；蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，以封閉液室溫封閉2 h后，加入一抗(1∶1 000 稀釋的小鼠血清)；4℃孵育過(guò)夜后TBST洗膜3次，然后加入二抗(1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠抗體)；室溫下孵育2 h后TBST洗膜3次，然后加ECL發(fā)光液顯影。

1.2.6重組RPLP0蛋白用于ELISA檢測(cè)抗核糖體P蛋白抗體 采用復(fù)性的重組RPLP0蛋白、Diarect公司的重組RPLP0蛋白分別包被酶標(biāo)板，然后加入不同濃度的抗核糖體P蛋白抗體人血清樣品，100 μl/孔，37℃孵育1 h；洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，100 μl/孔，37℃孵育1 h；洗滌后加入TMB顯色液，100 μl/孔，37℃孵育30 min；加入2 mol/L 硫酸，50 μl/孔，終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀上測(cè)定A450值。

1.2.7重組RPLP0蛋白特異性驗(yàn)證 采用1.2.6方法建立的ELISA反應(yīng)體系檢測(cè)常見(jiàn)自身抗體陽(yáng)性的血清樣本，以樣本OD450 nm/(0.10+陰性對(duì)照OD450 nm)<1.00，即S/CO<1.00作為陰性判讀標(biāo)準(zhǔn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以Diarect公司的重組RPLP0蛋白包被酶標(biāo)板，檢測(cè)患者血清中抗核糖體P蛋白抗體的OD值為因變量(x)；以純化重組RPLP0蛋白包被酶標(biāo)板，檢測(cè)患者血清中抗核糖體P蛋白抗體的OD值為自變量(y)；采用一元線性回歸分析兩者關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，得到一條明顯的目的條帶，如圖1A所示。其大小與設(shè)計(jì)的預(yù)期片段大小相符。

2.2質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 重組RPLP0蛋白基因與pET41a質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切、膠回收后，用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜；然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，然后對(duì)LB平板上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示，成功克隆出重組RPLP0蛋白基因，大小為954 bp；結(jié)果如圖1B所示。經(jīng)測(cè)序證實(shí)序列與設(shè)計(jì)序列完全相符。表明重組原核表達(dá)質(zhì)粒 pET41a-GST-RPLP0-6*His構(gòu)建成功。

2.3重組RPLP0蛋白的表達(dá) 表達(dá)菌體經(jīng)超聲波裂解后，收集上清液和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定蛋白表達(dá)方式。結(jié)果如圖2A所示，包涵體沉淀電泳帶出現(xiàn)一條表達(dá)條帶，與預(yù)期融合蛋白大小一致，分子量為61 kD。

2.4重組RPLP0蛋白的純化及復(fù)性 采用包涵體洗脫液、2 mol/L尿素溶液、8 mol/L尿素溶液對(duì)重組RPLP0蛋白進(jìn)行洗脫；電泳結(jié)果顯示：包涵體洗脫液和2 mol/L尿素溶液均不能將重組蛋白洗脫；該重組蛋白主要在8 mol/L尿素溶液中溶解，蛋白主帶清晰，總體純度大于85%，結(jié)果如圖2B。

將重組RPLP0蛋白復(fù)性后，采用SDS-PAGE電泳對(duì)復(fù)性上清液和復(fù)性沉淀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)性后的蛋白90%為可溶性狀態(tài)，蛋白純度>90%；結(jié)果如圖2C。

2.5重組RPLP0蛋白的免疫原性分析 復(fù)性的重組RPLP0蛋白免疫BALB/c小鼠后，小鼠血清中產(chǎn)生抗重組RPLP0蛋白的抗體。采用Western blot方法，用免疫后的小鼠抗血清來(lái)檢測(cè)Diarect公司的重組RPLP0，結(jié)果顯示，重組RPLP0蛋白免疫小鼠的抗血清能夠與Diarect公司的RPLP0蛋白發(fā)生反應(yīng)，在Mr 的35 kD附近出現(xiàn)明顯條帶，提示重組RPLP0蛋白具有足夠的免疫原性。結(jié)果如圖3所示。

圖1 重組RPLP0蛋白的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of PCR amplified product and identification of recombinant plasmidNote: A.Amplification of recombinant RPLP0 protein gene by PCR (M.Marker,1.Recombinant RPLP0 protein gene);B.Identifica-tion of recombinant plasmid (M.Marker,1-4.Positive colonies).

圖2 重組RPLP0蛋白的表達(dá)、純化及復(fù)性的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Expression,purification and renaturation of recom-binant RPLP0 proteinNote: A.Expression of recombinant RPLP0 protein (M.Marker,1.Liquid supernatant,2.Inclusion bodies)；B.Purification of recombinant RPLP0 protein (M.Marker,1.Inclusion body eluent,2. 2 mol/L urea solution,3. 8 mol/L urea solution)；C.Renaturation of recombinant RPLP0 protein (M.Marker,1.Refolding supernatant,2.Refolding precipitation).

圖3 重組RPLP0蛋白的免疫原性分析Fig.3 Immunogenicity of recombinant RPLP0 proteinNote: 1.20 ng RPLP0(Diarect);2.10 ng RPLP0(Diarect);3.5 ng RPLP0(Diarect).

圖4 兩種RPLP0蛋白檢測(cè)血清抗核糖體P蛋白抗體的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of serum anti-ribosomal phosphoprotein which was detected by two kinds of RPLP0 protein

表1 重組RPLP0蛋白與常見(jiàn)自身抗體交叉反應(yīng)情況

Tab.1 Specificity of recombinant RPLP0 protein

AutoantibodiesnLIAELISA(S/CO?)U1-nRNP63+0.61SmD163+0.53SS-A63+0.51SS-B63+0.31Scl-7063+0.26PM-Scl63+0.49Jo-163+0.53CENP-B63+0.43PCNA61+～2+0.55dsDNA62+～3+0.61NUC63+0.38AMA M263+0.39

Note：S/CO* was the mean of test for samples.

2.6重組RPLP0蛋白的抗體結(jié)合性分析 如圖4所示，以Diarect公司的RPLP0蛋白包被酶標(biāo)板，檢測(cè)患者血清中抗核糖體P蛋白抗體的OD值為因變量(x)；以復(fù)性的重組RPLP0蛋白包被酶標(biāo)板，檢測(cè)患者血清中抗核糖體P蛋白抗體的OD值為自變量(y)；進(jìn)行一元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，重組RPLP0蛋白包被酶標(biāo)板檢測(cè)血清抗核糖體P蛋白抗體的OD值與Diarect公司的RPLP0存在線性關(guān)系(F=6 175.000，P<0.000 1)，一元線性回歸方程為：y=0.993x + 0.016，R2= 0.973。這表明重組RPLP0蛋白具有良好的抗體結(jié)合性。

2.7重組RPLP0蛋白的特異性分析 用復(fù)性的重組RPLP0蛋白包被建立的ELISA反應(yīng)體系檢測(cè)抗U1-nRNP、SmD1、SS-A、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP-B、PCNA、dsDNA、NUC和AMA M2等常見(jiàn)自身抗體陽(yáng)性血清樣本，結(jié)果均為陰性。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

核糖體P蛋白是核糖體的主要組成部分，位于核糖體的活性部位；在蛋白質(zhì)的翻譯合成過(guò)程發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[1]。核糖體P蛋白分為P0、P1、P2三個(gè)亞單位；核糖體P1、P2蛋白通過(guò)P0錨定在核糖體上，這就構(gòu)成了核糖體活躍區(qū)的橫向“柄”結(jié)構(gòu)。在1994年Santos等[5]敲除酵母細(xì)胞中P1、P2而保留P0蛋白，細(xì)胞仍可存活，但敲除P0蛋白而保留P1、P2蛋白，細(xì)胞立即死亡。因此，相對(duì)P1、P2蛋白而言，核糖體P0蛋白對(duì)于維持生命活動(dòng)更重要。

自1985年Elkon等[6]在研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者時(shí)發(fā)現(xiàn)了抗核糖體P蛋白抗體以來(lái)，對(duì)抗核糖體P蛋白抗體的研究得到了人們的廣泛關(guān)注。很多研究表明，抗核糖體P蛋白抗體主要見(jiàn)于SLE；且早在SLE被確診前的1.7年就能檢測(cè)到抗核糖體P蛋白抗體的存在[7]。故抗核糖體P蛋白抗體作為SLE的特異性診斷指標(biāo)，或預(yù)示SLE疾病的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)[8]，使用重組RPLP0蛋白檢測(cè)抗核糖體P0蛋白抗體，比直接使用P蛋白檢測(cè)抗核糖體P蛋白抗體敏感性更高，這就提示抗RPLP0蛋白抗體的檢測(cè)對(duì)SLE診斷具有更高的敏感性，作為臨床上輔助診斷SLE的一項(xiàng)重要指標(biāo)，對(duì)SLE診斷具有重要意義。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)[2,9-12]，RPLP0蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在鼻咽癌、肝癌、胃癌、直腸癌及婦科腫瘤患者體內(nèi)RPLP0蛋白的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，提示RPLP0蛋白與腫瘤的發(fā)生存在著一定的相關(guān)性；且趙強(qiáng)等[11]研究還觀察到鼻咽癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中RPLP0 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高，這進(jìn)一步提示RPLP0蛋白可能與腫瘤發(fā)生生物侵襲有關(guān)。此外，RPLP0蛋白還是一個(gè)凋亡相關(guān)蛋白，在凋亡過(guò)程中起重要作用[9,12]。

利用基因重組技術(shù)獲取目的蛋白是目前最常用的方法，而親和標(biāo)簽融合技術(shù)不僅便于重組蛋白的純化和檢測(cè)，還可提高重組蛋白的表達(dá)量，增加重組蛋白的可溶性和穩(wěn)定性。本研究構(gòu)建了pET41a-GST-RPLP0-6*His原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中成功表達(dá)重組RPLP0蛋白。蛋白表達(dá)形式鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)重組RPLP0蛋白屬于包涵體表達(dá)；包涵體表達(dá)具有表達(dá)量高，易純化的優(yōu)點(diǎn)；但包涵體表達(dá)產(chǎn)物一般不具有生物學(xué)活性，需要對(duì)包涵體進(jìn)行溶解，并對(duì)其進(jìn)行復(fù)性，才能進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的活性和生物學(xué)方面研究。因此，在本研究中我們采用降低變性劑濃度的方法，使重組蛋白復(fù)性。

將復(fù)性得到的重組RPLP0蛋白免疫小鼠，所得到的小鼠抗血清能與Diarect公司的重組RPLP0蛋白發(fā)生反應(yīng)；且重組RPLP0蛋白也能與自身免疫性疾病患者血清中的抗核糖體P蛋白抗體結(jié)合。這表明該重組蛋白具有足夠的免疫原性和良好的免疫反應(yīng)性；同時(shí)重組蛋白與其他常見(jiàn)的自身抗體之間不存在交叉反應(yīng)，具有很好的特異性，其所攜帶的親和標(biāo)簽未對(duì)重組蛋白的蛋白活性、生物學(xué)功能產(chǎn)生影響，因而無(wú)需切除標(biāo)簽。

綜上所述，RPLP0蛋白是生命體不可或缺的蛋白質(zhì)，通過(guò)體外基因拼裝技術(shù)重組構(gòu)建表達(dá)RPLP0蛋白，為進(jìn)一步探討RPLP0蛋白的功能調(diào)節(jié)及基因表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。