葉加建 吳定昌 湯忠秀 李麗麗

(福建省老年醫(yī)院檢驗(yàn)科,福州 350003)

免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia purpura，ITP)是一種最常見的自身免疫性出血性疾病，主要臨床表現(xiàn)為血小板數(shù)目減少[1]。目前關(guān)于ITP發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，以往研究認(rèn)為抗原特異性自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞從而引起血小板減少癥[2]。ITP患者產(chǎn)生的血小板更大且更不成熟，而多數(shù)抗體易與血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa結(jié)合[3]。研究表明環(huán)氧化酶-1(Cyclooxygenase-1，COX-1)在調(diào)節(jié)血小板聚集方面發(fā)揮重要作用[4]。環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)與GPⅡb/Ⅲa及P-選擇素水平變化與血小板活化有關(guān)，且血小板濃度與聚集率之間呈正相關(guān)[5]。目前關(guān)于COX-1、COX-2在ITP患者血小板中表達(dá)的研究相對較少，本研究擬通過流式細(xì)胞術(shù)檢測ITP患者富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)中COX-1、COX-2的表達(dá)及其意義，為臨床指導(dǎo)個體化抗血小板治療提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1主要儀器及試劑 全血自動血細(xì)胞分析儀購自美國庫爾特公司，Coulter Epics XL MCL flow cytometer流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司，IsotonⅢ試劑購自美國Beckman Coulter公司，PE-CD42b抗體購自美國Becton Dickinson公司，F(xiàn)ITC-COX-1與FITC-COX-2抗體購自美國Cayman Chemical公司，鼠抗人IgG、IgM、IgA一抗購自法國Immunotech公司。

1.1.2臨床資料 選擇2015年3月至2017年2月于我院診治的65例免疫性血小板減少癥患者為研究組，另選取同期于我院進(jìn)行體檢的健康獻(xiàn)血者61例為對照組。收集兩組受試人員的一般資料包括年齡、性別等。納入標(biāo)準(zhǔn):①免疫性血小板減少癥患者符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②ITP患者均未接受過血小板輸注與脾切除治療；③未服用影響凝血功能藥物者；④患者知情且簽署同意書。知情同意書主要內(nèi)容包括研究背景、目的、不易參與人群、參加研究可能受益項(xiàng)及風(fēng)險、不良反應(yīng)及相關(guān)費(fèi)用情況等。排除標(biāo)準(zhǔn):①自身免疫性疾病患者；②精神病患者；③惡性腫瘤患者；④正在參加其他臨床試驗(yàn)者；⑤有血液系統(tǒng)疾病史者。兩組研究對象年齡、性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

1.2方法

1.2.1樣本采集 兩組研究對象均于次日清晨采集空腹靜脈血3 ml并置于3.2%枸櫞酸鈉抗凝管內(nèi)，1 h內(nèi)將其置于離心機(jī)轉(zhuǎn)速為200 r/min離心4 min，以此獲得PRP。

1.2.2標(biāo)記COX-1、COX-2 分別將PRP置于3個EP試管內(nèi)，每支試管裝25 μl，并將100 μl IsotonⅢ加入其中兩支試管，之后加入PE-CD42b抗體室溫下避光孵育，20 min后加入1%多聚甲醛固定10 min，然后用0.1%TritonX-100破膜，10 min后分別加入5 μl FITC-COX-1與FITC-COX-2抗體并避光孵育，20 min后采用1%多聚甲醛固定10 min，另外一支未加抗體的EP試管作為陰性對照。其中PE-CD42b可特異性識別血小板膜糖蛋白，因而雙陽性檢測結(jié)果可特異性反映血小板內(nèi)COX-1、COX-2表達(dá)。

1.2.3標(biāo)記血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)與血小板相關(guān)抗體 50 μl血小板懸浮液中分別加入IgG1PEE/IgG1FITC(10 μl)與CD41/CD61(10 μl)，并將其置于室溫靜置15 min后上機(jī)檢測。IgG、IgM、IgA單克隆抗體5 μl分別加入測定試管中，室溫靜置15 min后加入FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG，PBS清洗后上機(jī)檢測。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測 將處理好的血標(biāo)本于2 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測與分析，根據(jù)前群及側(cè)群的分布確定血小板的位置(門)并對門、電壓及補(bǔ)償進(jìn)行調(diào)整，計數(shù)1×104個血小板并記錄其熒光標(biāo)記抗體的陽性百分比即為COX-1、COX-2表達(dá)。

1.2.5觀察指標(biāo) 運(yùn)用血細(xì)胞自動分析儀檢測抗凝試管內(nèi)靜脈血的血小板參數(shù)并觀察血小板參數(shù)的變化，包括血小板計數(shù)(PLT)、血小板比積(PCT)、平均血小板體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)。

2 結(jié)果

2.1兩組臨床資料的比較 研究組PLT、PCT、PDW、GPⅡb/Ⅲa顯著低于對照組(P<0.05)，而MPV、PAIgG、PAIgM、PAIgA明顯高于對照組(P<0.05)，詳見表1。

2.2兩組血小板COX-1、COX-2表達(dá)的檢測結(jié)果 兩組血小板COX-1、COX-2表達(dá)存在明顯差異，研究組患者血小板內(nèi)COX-1、COX-2陽性百分比均顯著高于對照組(P<0.05)，詳見圖1、表2。

Tab.1 Comparison of clinical data between two groups

ClinicalindicatorsControlgroup(n=61)Researchgroup(n=65)χ2/tPAge47.58±7.9348.02±8.030.3090.758Gender(n)0.3420.559Male2530Female3635Platelet parametersPLT(×109 L-1)125.36±20.0162.58±2.2325.1360.000MPV(fl)6.23±1.0410.21±1.0321.5750.000PCT(%)1.25±0.230.34±0.0431.4040.000PDW15.23±2.0112.72±1.617.7590.000Platelet-associated antibodyPAIgG(%)11.48±3.8229.21±9.7313.3000.000PAIgM(%)9.58±3.1923.57±7.8612.9350.000PAIgA(%)7.54±1.2621.34±7.1114.9370.000GPⅡb/Ⅲa(%)93.27±31.0967.78±22.535.2930.000

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板內(nèi)COX-1和COX-2的表達(dá)Fig.1 Flow cytometry to detect the expression of COX-1 and COX-2 in plateletsNote: A,B. The control group and the research group COX-1 respectively;C,D. The control group and the research group COX-2 respectively.

GroupsnCOX-1COX-2Control group6115.21±1.2318.34±2.36Research group6542.35±3.571)66.18±12.671)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

2.3血小板COX-1、COX-2表達(dá)與患者臨床指標(biāo)的關(guān)系 Pearson法分析免疫性血小板減少癥患者血小板內(nèi)COX-1、COX-2表達(dá)與患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示COX-1、COX-2均與MPV、PAIgG、PAIgM、PAIgA呈正相關(guān)，而均與PLT、PCT、GPⅡb/Ⅲa呈負(fù)相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。

2.4ROC分析血小板COX-1、COX-2對免疫性血小板減少癥的診斷價值 ROC分析結(jié)果顯示COX-1的敏感度為69.23%、特異度為90.62%、截斷值為17.63，COX-2的敏感度為78.46%、特異度為84.37%、截斷值為23.95，詳見圖3、表4。

2.5免疫性血小板減少癥發(fā)生的相關(guān)因素分析 將影響免疫性血小板減少癥發(fā)生的相關(guān)因素進(jìn)行Logistic分析，結(jié)果顯示MPV、PCT、PAIgG、PAIgA、GPⅡb/Ⅲa、COX-1與COX-2均為免疫性血小板減少癥發(fā)生的危險因素，詳見表5。

表3 患者血小板COX-1、COX-2表達(dá)與血小板參數(shù)的關(guān)系

Tab.3 Relationship between expression of COX-1 and COX-2 and platelet parameters in patients with platelets

PlateletparametersCOX-1rPCOX-2rPPLT-0.2720.029-0.3500.004MPV0.5790.0000.7110.000PCT-0.2880.020-0.4440.000PDW-0.1130.372-0.1740.165PAIgG0.3010.0150.4530.000PAIgM0.2680.0310.4970.000PAIgA0.4460.0000.5280.000GPⅡb/Ⅲa-0.5430.000-0.6400.000

圖3 免疫性血小板減少癥血小板COX-1和COX-2的ROC分析Fig.3 ROC analysis of platelet COX-1 and COX-2 in immune thrombocytopenia

表5 影響免疫性血小板減少癥發(fā)生的相關(guān)因素的多因素分析

Tab.5 Multivariate analysis of factors affecting the occurrence of immune thrombocytopenia

Influencing factorβSEWald/χ2POR95%CIAge0.3040.2122.0500.3761.3551.123～1.634Gender0.4990.3202.4270.2681.6461.347～2.012MPV1.0070.4365.3360.0242.7382.182～3.435PCT0.9730.4285.1650.0372.6451.765～3.964COX-11.0730.4136.7460.0132.9232.124～4.023COX-21.1420.4028.0690.0023.1332.247～4.368PAIgG1.0770.4336.1840.0112.9352.147～4.013PAIgM0.7970.4413.2650.3582.2191.847～2.665PAIgA1.0470.4375.7420.0222.8502.024～4.012GPⅡb/Ⅲa0.7640.3126.0000.0152.1471.748～2.638

表4 免疫性血小板減少癥血小板COX-1和COX-2的ROC分析

Tab.4 ROC analysis of platelet COX-1 and COX-2 in immune thrombocytopenia

IndexAUCStandard errorZ statistics95%CIPCOX-10.8500.03410.260.777～0.907<0.000COX-20.7930.0417.1410.713～0.860<0.000

3 討論

ITP主要由機(jī)體多種免疫功能異常導(dǎo)致血小板破壞增加或生成減少所致，嚴(yán)重時危及生命安全[7]。以往研究認(rèn)為血小板活性增強(qiáng)與機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂在ITP的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[8,9]。機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致患者體內(nèi)抗血小板抗體與血小板結(jié)合進(jìn)而破壞網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)并導(dǎo)致血小板數(shù)量減少[10]。研究表明抗血小板藥物可促使COX-1乙?；p少花生四烯酸代謝產(chǎn)物血栓素A2的產(chǎn)生進(jìn)而抑制血小板凝集[11]。相關(guān)研究顯示，COX-1、COX-2基因多態(tài)性在血小板活性增強(qiáng)、抗血小板過程中具有關(guān)鍵作用。當(dāng)前臨床通過排除其他引起的血小板減少癥病因進(jìn)行ITP診斷，且缺乏敏感性及特異性的診斷指標(biāo)。因此，本研究分析血小板COX-1、COX-2在免疫性血小板減少癥中的臨床應(yīng)用價值。

COX-1可在花生四烯酸生物合成前列腺素過程中發(fā)揮重要作用，研究表明惡性腫瘤組織中COX-1表達(dá)水平顯著升高并可作為診斷疾病的重要指標(biāo)[13]。原發(fā)性血小板增多癥患者COX-1表達(dá)與其在健康個體內(nèi)的表達(dá)并無明顯差異[14]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測所有研究對象血小板內(nèi)COX-1表達(dá)水平，結(jié)果顯示研究組患者血小板內(nèi)COX-1表達(dá)顯著高于對照組，這可能是由于ITP患者血小板破壞程度增加所致[15]。血小板參數(shù)可反映血小板生成與衰亡，其中PLT是監(jiān)測凝血狀況的常規(guī)指標(biāo)，PCT與PLT變化基本一致，MPV可反映骨髓中巨核細(xì)胞代謝及血小板生成情況，PDW可反映血小板大小的異質(zhì)性及分布的趨勢[16]。與此相似，本研究結(jié)果也顯示研究組患者PLT、PCT、PDW均顯著低于對照組，而MPV顯著高于對照組，此外研究組GPⅡb/Ⅲa顯著低于對照組，而PAIgG、PAIgM、PAIgA明顯高于對照組，進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)性分析顯示COX-1表達(dá)與MPV、PAIgG、PAIgM、PAIgA呈顯著正相關(guān)，而與PLT、PCT、GPⅡb/Ⅲa呈顯著負(fù)相關(guān)，說明COX-1參與ITP疾病發(fā)生過程。提示COX-1異常并通過與自身血小板抗原作用促使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體從而激活B淋巴細(xì)胞最終導(dǎo)致ITP患者病情加重。

COX-2是一種誘導(dǎo)酶并可通過MAPK依賴的磷酸化途徑抑制過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPAR-γ)表達(dá)進(jìn)而引起Th細(xì)胞亞群紊亂[17]。相關(guān)研究表明Treg/Th17細(xì)胞平衡失調(diào)可能引發(fā)原發(fā)免疫性血小板減少癥并可促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展[18]。本研究結(jié)果顯示研究組患者血小板內(nèi)COX-2陽性百分比顯著高于對照組，與文獻(xiàn)報道相似[19]，說明ITP患者血小板內(nèi)COX-2呈高表達(dá)。分析其原因可能為COX-2高表達(dá)可造成細(xì)胞免疫功能紊亂，同時可通過T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用直接破壞血小板進(jìn)而導(dǎo)致血小板破壞增加。觀察COX-2表達(dá)與ITP患者臨床指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果顯示COX-2與MPV、PAIgG、PAIgM、PAIgA呈顯著正相關(guān)，而與PLT、PCT、GPⅡb/Ⅲa呈顯著負(fù)相關(guān)，說明COX-2與ITP發(fā)生及血小板代謝密切相關(guān)。提示COX-2通過引發(fā)機(jī)體免疫功能異常并促使抗體水平升高從而促使GPⅡb/Ⅲa減少，并可抑制其黏附、聚集功能導(dǎo)致ITP的發(fā)生。

既往檢測COX-1、COX-2多采用酶聯(lián)免疫吸附法，或Western blot方法檢測血小板COX-1、COX-2蛋白水平，但對血小板極少的患者檢測結(jié)果存在較大偏差，且操作過程中易破壞和激活血小板[20]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測COX-1、COX-2表達(dá)并采用ROC法分析顯示COX-1與COX-2具有較高的靈敏度與特異度，說明COX-1與COX-2在ITP的診斷中具有較高的應(yīng)用價值，且二者的截斷值可作為陽性診斷界值進(jìn)而提高ITP診斷的敏感性及特異性。說明COX-1與COX-2共同作用并可反映免疫性血小板減少癥的進(jìn)展情況，分析原因可能為ITP患者血小板COX-1與COX-2異常表達(dá)可促使細(xì)胞免疫功能紊亂進(jìn)而影響血小板的正常代謝。同時本研究將影響ITP疾病發(fā)生的相關(guān)因素進(jìn)行Logistic分析，結(jié)果顯示COX-1與COX-2均為免疫性血小板減少癥發(fā)生的危險因素。本研究結(jié)果揭示通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測血小板COX-1、COX-2蛋白水平可有效反映ITP患者的疾病狀態(tài)并為臨床疾病診斷提供重要的參考依據(jù)。

綜上所述，ITP患者血小板COX-1與COX-2均呈高表達(dá)，二者呈顯著正相關(guān)關(guān)系且共同參與ITP疾病發(fā)生及進(jìn)展過程，血小板COX-1與COX-2表達(dá)異常在ITP發(fā)病過程中可能發(fā)揮重要作用。關(guān)于血小板COX-1與COX-2在ITP發(fā)病中的作用機(jī)制將有待進(jìn)一步研究。