盧 意 蔡海波 譚文松

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(Cytokine-induced killer，CIK)治療的原理是通過回輸自體腫瘤特異性T細(xì)胞，使T細(xì)胞特異性識(shí)別并清除患者體內(nèi)的靶細(xì)胞，從而起到抗癌的作用[1,2]。CIK細(xì)胞是一類異質(zhì)型細(xì)胞群，其中主要效應(yīng)細(xì)胞為CD3+CD56+細(xì)胞，而CD8+細(xì)胞可輔助CD3+CD56+細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞[3-5]。CIK細(xì)胞可通過穿孔素和顆粒酶B的釋放來發(fā)揮其生物學(xué)毒性[6,7]。治療用CIK細(xì)胞通常來源于患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，但是外周血中殺傷細(xì)胞數(shù)量有限，無法滿足臨床輸注要求[8-10]，必須通過體外擴(kuò)增才能解決解決這一問題。

作為一類生物大分子，多糖廣泛存在于自然界的高等和低等生物中。研究表明很多多糖具有促進(jìn)免疫細(xì)胞體外增殖的生物活性，如人參多糖、麥麩多糖、金耳多糖等[11-13]。Leung等[14]發(fā)現(xiàn)隨著甘露糖含量的增加，蘆薈多糖的免疫調(diào)節(jié)活性增強(qiáng)。Inngjerdingen等[15]發(fā)現(xiàn)改變單糖組成、降低分子量會(huì)削弱果膠的生物活性?？梢姡嗵堑纳锘钚耘c其單糖組成相關(guān)。黃原膠是一類由植物致病菌產(chǎn)生的胞外雜多糖，由葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)和葡萄糖醛酸(GlcA)以2∶2∶1的比例組成，它廣泛應(yīng)用于食品和制藥行業(yè)中的增稠劑和穩(wěn)定劑[16,17]。課題組前期工作發(fā)現(xiàn)在無血清培養(yǎng)基中添加黃原膠有利于CIK細(xì)胞在高密度條件下的擴(kuò)增[18]。然而，黃原膠即使在低濃度條件下仍具有較高的黏度，且加熱也無法改變其黏度[19,20]，因此，難以應(yīng)用于培養(yǎng)基的制備。為此，本文基于黃原膠的單糖組成，研究葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸三種單糖對(duì)CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響，以期為適用于CIK細(xì)胞擴(kuò)增的無血清培養(yǎng)基的研制提供依據(jù)。

本文首先利用正交實(shí)驗(yàn)確定最適合CIK細(xì)胞擴(kuò)增的單糖組合和添加劑量，并以總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、培養(yǎng)物種效應(yīng)細(xì)胞比例和擴(kuò)增倍數(shù)、效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)顆粒酶B和穿孔素的細(xì)胞比例、CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性為指標(biāo)，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)袋在無血清培養(yǎng)體系中考察該組合對(duì)CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增及功能的影響，為CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)化提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 RMPI1640培養(yǎng)基購于美國Thermo公司；胎牛血清購于上海BioSun公司；無血清培養(yǎng)基購于上海Bioengine公司；重組人γ干擾素(rIFN-γ)、重組人白細(xì)胞介素2(rIL-2)、重組人白細(xì)胞介素1α(rIL-1α)均購于美國Peprotech公司；鼠抗人CD3單克隆抗體(OKT-3)購于美國eBioscience公司；植物血凝素(PHA)購于Sigma-Aldrich公司；FITC標(biāo)記的鼠抗人CD3抗體、PE標(biāo)記的鼠抗人CD56抗體、PerCP-Cy5.5標(biāo)記的鼠抗人CD8抗體、V450標(biāo)記的鼠抗人顆粒酶B抗體、BV421標(biāo)記的鼠抗人穿孔素抗體均購于美國BD公司；D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸分別購于美國Amresco公司、上海笛柏生物科技有限公司、上海Macklin公司；Cultilife215細(xì)胞培養(yǎng)袋購于日本TaKaRa公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1CIK細(xì)胞培養(yǎng) 將新鮮分離的PBMC置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)環(huán)境中，第0天加入IFN-γ，終濃度為1 000 U/ml，24 h 后補(bǔ)加IL-2、OKT3、IL-1α、PHA，終濃度分別為500 U/ml、50 ng/ml、100 U/ml和500 ng/ml，細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)補(bǔ)入新鮮培養(yǎng)基和IL-2(500 U/ml)。每天取樣，采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)得到活細(xì)胞密度。

1.2.2細(xì)胞表型分析 收取(5～10)×105個(gè)細(xì)胞，分別采用FITC-CD3、PE-CD56、PerCP-CD8流式抗體標(biāo)記細(xì)胞，4℃孵育30 min后應(yīng)用FACS Aria流式細(xì)胞儀(美國BD公司)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表型檢測(cè)，最后用FlowJo 7.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

1.2.3表達(dá)顆粒酶B、穿孔素的效應(yīng)細(xì)胞比例分析 收集4×106個(gè)培養(yǎng)后的CIK細(xì)胞，分成4組，一組作為對(duì)照組，一組標(biāo)記FITC-CD3、PE-CD56、PerCP-CD8抗體，另外兩組除標(biāo)記以上三種流式抗體外分別標(biāo)記V450-顆粒酶B和BV421-穿孔素流式抗體。標(biāo)記細(xì)胞表面抗原CD3、CD56和CD8后分別用固定液和破膜液處理細(xì)胞，添加V450-顆粒酶B和BV421-穿孔素抗體，最后結(jié)合流式細(xì)胞儀和FlowJo軟件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.4CIK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè) 將CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞(E)，K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞(T)，將1×105個(gè)CIK細(xì)胞和1×104個(gè)K562細(xì)胞按照效靶比10∶1(E∶T=10∶1)接種于100 μl 含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，并置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。之后每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2～4 h，最后用酶標(biāo)儀測(cè)出各孔培養(yǎng)液在450 nm處的OD值。此外設(shè)置空白對(duì)照組，在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加CCK-8試劑，排除培養(yǎng)基對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。CIK細(xì)胞、K562細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)和兩者共培養(yǎng)后檢測(cè)得到的OD值均減去空白對(duì)照組的OD值，最后分別用ODE、ODT、ODET表示，殺傷活性(Cytotoxicity)由下式計(jì)算：Cytotoxicity=[1-(ODET-ODE)/ODT]×100%。

1.2.5DOE軟件實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本文采用的DOE軟件是minitab17，基于此軟件進(jìn)行田口設(shè)計(jì)，即正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[21,22]。

2 結(jié)果

2.1最優(yōu)單糖組合和添加劑量的確定 在無血清培養(yǎng)基體系中考察單糖種類和添加劑量對(duì)CIK細(xì)胞擴(kuò)增的影響。針對(duì)葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸三種單糖，利用minitab17軟件設(shè)計(jì)一個(gè)三因子四水平正交實(shí)驗(yàn)，其中三因子A、B、C分別代表葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，每種單糖設(shè)4個(gè)添加劑量，葡萄糖和甘露糖的4個(gè)添加劑量均為0.000、0.022、0.220、2.200 mmol/L，而葡萄糖醛酸的添加劑量為0.000、0.010、0.100、1.000 mmol/L(見表1)。根據(jù)軟件選取L16(45)安排實(shí)驗(yàn)，不考慮交互作用，總共設(shè)計(jì)16個(gè)正交實(shí)驗(yàn)組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

對(duì)16組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行直觀分析，結(jié)果如表2和圖1所示。首先將表2中3次實(shí)驗(yàn)中第14天的總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)X1～X3求和得到Y(jié)值，進(jìn)一步求出各因子對(duì)應(yīng)于不同水平的Y值的平均值，即K1～K4，從而得出均值主效應(yīng)圖(圖1)。將表2中3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)堆疊，進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。結(jié)合直觀分析和方差分析的結(jié)果可知，在所選擇的添加劑量范圍內(nèi)，最優(yōu)點(diǎn)為A4B4C3，即葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸的添加劑量分別為2.200、2.200、0.100 mmol/L，其中甘露糖、葡萄糖醛酸對(duì)總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的影響顯著(P<0.05)。

表1 三因子四水平正交設(shè)計(jì)

Tab.1 Three-factor four-level orthogonal design

LevelsFactorA(mmol/L)B(mmol/L)C(mmol/L)10.0000.0000.00020.0220.0220.01030.2200.2200.10042.2002.2001.000

表2 三因子四水平正交實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)14 d的總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的直觀分析

Tab.2 Visual analysis of expansion fold of total cells for 14 d cell culture in three-factor four-level orthogonal test

GroupsABCExpansion fold of total cellsX1X2X3SumY11115.615.618.539.7212222.824.222.769.7313314.623.624.562.7414421.434.631.387.352125.816.820.943.562218.215.617.441.2723418.619.628.766.9824323.836.633.694.0931323.024.622.269.81032414.810.621.847.2113319.214.87.431.41234216.624.823.164.51341426.027.821.875.61442314.221.626.862.61543214.223.223.661.01644121.622.023.467.0K164.857.244.8K261.455.259.7K353.255.572.3K466.578.269.3Delta13.323.027.4Rank321

然而，上述正交實(shí)驗(yàn)中的最優(yōu)點(diǎn)處于三種單糖添加劑量范圍的邊界上，無法確定三者的最適添加劑量。因此，進(jìn)一步調(diào)整三種單糖的添加劑量范圍，設(shè)計(jì)了三因子三水平的正交實(shí)驗(yàn)(表4)，其中葡萄糖和甘露糖的添加劑量均選取0.22、2.20、22.00 mmol/L，葡萄糖醛酸的添加劑量則選取0.10、1.00、10.00 mmol/L。根據(jù)軟件選取L9(34)共9個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，直觀分析結(jié)果如表5和圖2所示。由圖2可以看出，在所選擇的添加劑量范圍內(nèi)，最優(yōu)點(diǎn)為A1B2C1，即當(dāng)葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸的添加劑量分別為0.22、2.20、0.10 mmol/L時(shí)總細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)最高。

圖1 三因子四水平正交實(shí)驗(yàn)的均值主效應(yīng)圖(n=3)Fig.1 Main effect map of mean of three-factor four-level orthogonal test(n=3)

表3 三因子四水平正交實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)14 d后的總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的方差分析

Tab.3 Variance analysis of expansion fold of total cells for 14 d cell culture in three-factor four-level orthogonal test

SourceDOFAdj SSAdj MSF值P值A(chǔ)3140.446.801.620.200B3498.7166.245.770.002C3609.7203.247.060.001Error381 094.528.80Lack of fit6234.739.111.460.225Pure of Error32859.826.87Cor Total472 343.3

表4 三因子三水平正交設(shè)計(jì)

Tab.4 Three-factor three-level orthogonal design

LevelsFactorA(mmol/L)B(mmol/L)C(mmol/L)10.220.220.1022.202.201.00322.0022.0010.00

考慮到無血清培養(yǎng)基中葡萄糖含量在10 mmol/L以上，葡萄糖的添加對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響可以忽略不計(jì)。因此，確定2.20 mmol/L 甘露糖和 0.10 mmol/L葡萄糖醛酸為最優(yōu)單糖組合以及添加劑量。

2.2甘露糖和葡萄糖醛酸組合應(yīng)用對(duì)CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增及其細(xì)胞功能的影響 在無血清培養(yǎng)基體系中考察添加2.20 mmol/L甘露糖和0.10 mmol/L葡萄糖醛酸對(duì)CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增以及功能的影響。

表5 三因子三水平正交實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)14 d后的總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的直觀分析

Tab.5 Visual analysis of expansion fold of total cells for 14 d cell culture in three-factor three-level orthog-onal test

GroupsABCExpansion fold of total cellsX1X2X3SumY111117.972.636.8127.3212241.646.144.5132.2313319.713.123.556.342129.728.56.444.6522321.235.819.776.8623137.168.234.1139.573137.327.026.460.7832117.638.240.396.093320.08.20.08.2K1105.377.5120.9K287.0101.761.7K355.068.064.6Delta50.333.759.2Rank231

圖2 三因子三水平正交實(shí)驗(yàn)的均值主效應(yīng)圖(n=3)Fig.2 Main effect map of mean of three-factor three-level orthogonal test(n=3)

無血清培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，將新鮮分離的PBMCs以1×106cells/ml的細(xì)胞密度接種于裝有20 ml 添加甘露糖和葡萄糖醛酸的無血清培養(yǎng)基的T75方瓶中，并按1.2.1中所述的方法加入細(xì)胞因子刺激CIK細(xì)胞生成；培養(yǎng)4 d后細(xì)胞密度恢復(fù)至初始接種密度轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)袋中，每天取樣計(jì)數(shù)，隔天補(bǔ)入新鮮的培養(yǎng)基和細(xì)胞因子維持細(xì)胞密度為1×106cells/ml，總共培養(yǎng)14 d。

2.2.1CIK細(xì)胞的擴(kuò)增 培養(yǎng)過程中細(xì)胞活性以及總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)如圖3所示。從中可以看出，無論是否添加甘露糖和葡萄糖醛酸，在整個(gè)培養(yǎng)過程中細(xì)胞活性均維持在80%以上(圖3A)，而培養(yǎng)14 d后添加甘露糖和葡萄糖醛酸組的總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)為29.38±5.20，顯著高于對(duì)照組的18.36±4.03(P<0.05)(圖3B)?？梢?，甘露糖和葡萄糖醛酸組合應(yīng)用可促進(jìn)總細(xì)胞的擴(kuò)增。

經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測(cè)可以得到培養(yǎng)物中CD3+、CD3+CD56+、CD3+CD8+細(xì)胞的比例，見表6?？梢钥闯?，PBMC中CD3+、CD3+CD56+、CD3+CD8+細(xì)胞的初始比例分別為(35.32±8.15)%、(4.42±0.65)%、(12.80±0.95)%，體外培養(yǎng)14 d后添加甘露糖和葡萄糖醛酸組中三類效應(yīng)細(xì)胞的比例分別增至(91.67±2.57)%、(15.93±3.78)%、(57.47±3.81)%，與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)?？梢姡事短呛推咸烟侨┧峤M合應(yīng)用不影響各類效應(yīng)細(xì)胞的比例。

圖3 甘露糖和葡萄糖醛酸組合應(yīng)用對(duì)總細(xì)胞擴(kuò)增的影響Fig.3 Effect of combined application of mannose and glucuronic acid on total cell expansionNote: A.Cell viability;B.Expansion fold of total cells;n=3.Compare with control，*.P<0.05.

表6 甘露糖和葡萄糖醛酸組合應(yīng)用對(duì)各類效應(yīng)細(xì)胞比例的影響(n=3)

Tab.6 Effect of combined application of mannose and glucuronic acid on percentage of effector cells (n=3)

Culturetime (d)The percentage of effector cells in the control group (%)CD3+cellsCD3+CD56+cellsCD3+CD8+cellsThe percentage of effector cells in the Man+GlcA group (%)CD3+cellsCD3+CD56+cellsCD3+CD8+cells035.32±8.154.42±0.6512.80±0.9535.32±8.154.42±0.6512.80±0.951489.80±3.2114.23±2.3754.63±6.0991.67±2.5715.93±3.7857.47±3.81

圖4 甘露糖和葡萄糖醛酸組合應(yīng)用對(duì)各類效應(yīng)細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的影響(n=3)Fig.4 Effect of combined application of mannose and glucuronic acid on expansion fold of effector cells (n=3)Note: Compare with control，*.P<0.05.

圖5 甘露糖和葡萄糖醛酸組合對(duì)效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)顆粒酶B和穿孔素的細(xì)胞比例的影響Fig.5 Effect of combined application of mannose and glucuronic acid on percentage of Granzyme B+ cells and Perforin+ cells in effector cellsNote: A.The percentage of Granzyme B+ cells in effector cells;B. The percentage of Perforin+ cells in effector cells;n=3.*. P<0.05.

各類效應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)如圖4所示。培養(yǎng)14 d后添加甘露糖和葡萄糖醛酸組中CD3+、CD3+CD56+、CD3+CD8+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)分別為87.96±16.95、113.17±31.87、128.73±16.45，明顯高于對(duì)照組的53.87±12.57、63.69±19.52、77.14±20.35(P<0.05)?？梢姡事短呛推咸烟侨┧峤M合應(yīng)用可促進(jìn)各類效應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)增。

圖6 甘露糖和葡萄糖醛酸組合對(duì)擴(kuò)增后CIK細(xì)胞的殺傷活性的影響(n=3)Fig.6 Effect of combined application of mannose and glucuronic acid on cytotoxicity of expanded CIK cells (n=3)Note: Compare with control，*.P<0.05.

2.2.2CIK細(xì)胞的功能 CIK細(xì)胞可通過分泌顆粒酶B和穿孔素發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的功效，檢測(cè)各類效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)顆粒酶B和穿孔素細(xì)胞的比例，結(jié)果見圖5。培養(yǎng)14 d后，添加甘露糖和葡萄糖醛酸組的各類效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)顆粒酶B和穿孔素的細(xì)胞比例均有所提高，其中CD3+CD8+細(xì)胞中表達(dá)顆粒酶B的細(xì)胞比例為(50.00±17.64)%，顯著高于對(duì)照組的(40.87±19.48)%(P<0.05)(圖5A)；而 CD3+細(xì)胞和CD3+CD56+細(xì)胞中表達(dá)穿孔素的細(xì)胞比例分別為(57.00±7.50)%和(49.47±7.15)%，顯著高于對(duì)照組的(28.60±6.27)%和(30.80±4.71)%(P<0.05)(圖5B)?？梢?，甘露糖和葡萄糖醛酸組合應(yīng)用可提高CIK細(xì)胞中表達(dá)顆粒酶B和穿孔素的細(xì)胞比例。

添加甘露糖和葡萄糖醛酸對(duì)擴(kuò)增后CIK細(xì)胞腫瘤殺傷活性的影響見圖6。當(dāng)培養(yǎng)14 d后的CIK細(xì)胞與K562細(xì)胞以10∶1的效靶比共培養(yǎng)時(shí)，添加甘露糖和葡萄糖醛酸組所擴(kuò)增的CIK細(xì)胞的殺傷活性為(29.03±4.34)%，顯著高于對(duì)照組的(17.93±2.65)%(P<0.05)。可見，在無血清培養(yǎng)基中添加甘露糖和葡萄糖醛酸組合，有助于提高擴(kuò)增后CIK細(xì)胞的殺傷活性。

3 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道，采用CIK細(xì)胞治療有利于提高肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和胃癌等癌癥患者的無進(jìn)展生存期和總生存期[23]，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。而如何獲取足夠數(shù)量且具有功能的CIK細(xì)胞是細(xì)胞治療領(lǐng)域所需要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題之一。由于血清成分復(fù)雜，實(shí)際應(yīng)用中血清培養(yǎng)存在諸多限制，因此，開發(fā)高效無血清培養(yǎng)基成了細(xì)胞治療級(jí)效應(yīng)細(xì)胞體外擴(kuò)增領(lǐng)域的熱點(diǎn)[24]。

本文在前期工作中發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞在添加黃原膠的無血清培養(yǎng)基中具有較好的擴(kuò)增效果的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)組成黃原膠的葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸的最優(yōu)組合和最適添加劑量進(jìn)行了探索。研究發(fā)現(xiàn)利用添加2.20 mmol/L甘露糖、0.10 mmol/L葡萄糖醛酸的無血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)PBMCs時(shí)，總細(xì)胞數(shù)目在14 d內(nèi)擴(kuò)增了(29.38±5.20)倍，其中主要效應(yīng)細(xì)胞CD3+CD56+細(xì)胞的比例可達(dá)到(15.93±3.78)%，擴(kuò)增倍數(shù)為113.17±31.87，均明顯高于不添加甘露糖、葡萄糖醛酸的對(duì)照組(P<0.05)。此外，效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)顆粒酶B和穿孔素的細(xì)胞比例也明顯高于對(duì)照組，且擴(kuò)增后CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性也顯著提高(P<0.05)。因此可以說明甘露糖和葡萄糖醛酸的組合應(yīng)用可在促進(jìn)CIK細(xì)胞有效擴(kuò)增的同時(shí)提高CIK細(xì)胞的腫瘤殺傷能力。該結(jié)果可為CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)化提供技術(shù)支持。

然而，甘露糖和葡萄糖醛酸促進(jìn)CIK細(xì)胞擴(kuò)增的作用機(jī)理尚不明確。相關(guān)研究表明甘露糖可刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子，同時(shí)具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖和分化的功能[25-27]。Lewis等[28]發(fā)現(xiàn)葡萄糖醛酸可作用于免疫細(xì)胞表面的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1、IL-6等促炎癥因子的釋放。因此，后續(xù)研究將從細(xì)胞因子分泌和信號(hào)通路激活的角度進(jìn)一步探究甘露糖、葡萄糖醛酸促進(jìn)CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增的機(jī)理。