戴迪 靳貴林 崔治家 楊扶德 邵士俊

摘要：目的? 通過研究枸杞子水提部位的熒光特性，為枸杞子鑒定與質(zhì)量評價提供依據(jù)。方法? 采用紫外吸收光譜、熒光激發(fā)譜、熒光發(fā)射譜、三維熒光光譜的多維光譜結(jié)合方法得到枸杞子水提取部位的全方位光譜特征信息，并對特征熒光峰進(jìn)行表征。結(jié)果? 枸杞子水提部位有2個明顯的特征熒光峰，分別在激發(fā)波長（Ex）280 nm/發(fā)射波長（Em）340 nm與Ex 340 nm/Em 450 nm處，且熒光強(qiáng)度與濃度有關(guān)，受溫度、酸堿度、共存離子影響;對照品東莨菪內(nèi)酯、色氨酸的三維熒光光譜峰位置與之相似。結(jié)論? 采用水提部位熒光光譜圖可對枸杞子進(jìn)行定性鑒別，特征熒光峰初步推斷為以色氨酸為代表的氨基酸類組分和東莨菪內(nèi)酯類組分。

關(guān)鍵詞：枸杞子;熒光特性;三維熒光光譜;中藥鑒定

中圖分類號：R284.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）07-0079-05

Abstract： Objective To study the fluorescence characteristics of the water extracting parts of Lycii Fructus; To provide a basis for the identification and quality evaluation of Lycii Fructus. Methods Multi-dimensional spectroscopy including ultraviolet absorption spectroscopy， fluorescence excitation spectroscopy， fluorescence emission spectroscopy and three-dimensional fluorescence spectroscopy were used to obtain the omnidirectional spectral characteristics of the water extracting part of Lycii Fructus， and the characteristic fluorescence peaks were characterized. Results There were two distinct characteristic fluorescence peaks in the water extracting parts of Lycii Fructus， which were at Ex 280 nm/Em 340 nm and Ex 340 nm/Em 450 nm， respectively. The fluorescence intensity was related to concentration， affected by temperature， pH value and coexisting ions; the three-dimensional fluorescence peak positions of scopoletin and tryptophan were similar to Lycii Fructus. Conclusion The fluorescence spectrum of the water extracting parts can be used to qualitatively identify Lycii Fructus. It is preliminarily concluded that the characteristic fluorescent peaks were the amino acid component represented by tryptophan and scopoletin component.

Keywords： Lycii Fructus; fluorescence characteristics; three-dimensional fluorescence spectroscopy; identification of TCM

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實，其味甘性平，有滋補(bǔ)肝腎、益精明目功效[1]。研究表明，枸杞子具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抗疲勞等多種藥理作用[2-8]。枸杞的某些化學(xué)成分具有發(fā)射熒光的特性，如黃酮類、生物堿類、酚酸類、氨基酸與蛋白質(zhì)等，目前枸杞的定性定量鑒別主要采用紫外光譜、紅外光譜、液相色譜等方法[9-12]，但對其熒光光譜特性鮮有報道。中藥傳統(tǒng)用藥為水煎劑，前期試驗發(fā)現(xiàn)枸杞子水提液具有良好的熒光性質(zhì)，故有必要深入研究其全譜信息。本研究采用多維光譜方法得到枸杞子水提取部位的全面光譜信息，對影響熒光的因素進(jìn)行考察，并初步研究其特有的熒光組分，對熒光峰的歸屬進(jìn)行表征，為枸杞子的快速鑒別和質(zhì)量評價提供參考。

1? 儀器與試藥

Lambda35紫外可見分光光度計（美國PerkinElmer公司），F(xiàn)luorolog-3熒光光譜儀（美國HORIBA公司），PB-10/C標(biāo)準(zhǔn)型pH計（Sartorius），JB-040S潔盟牌超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）。

枸杞子樣品采集于寧夏自治區(qū)中寧縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實。色氨酸（上海麥克林生化科技有限公司，批號C10024582）、苯丙氨酸（國藥化學(xué)試劑有限公司，批號20141211）、酪氨酸（國藥化學(xué)試劑有限公司，批號20150208）、東莨菪內(nèi)酯（成都普思生物科技股份有限公司，批號PS1345-0025）、葡萄糖（國藥化學(xué)試劑有限公司，批號10010518）、果糖（中國食品藥品檢定研究院，批號111504-200001），水為超純水，其他試劑為分析純。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 熒光光譜測定條件優(yōu)化

參數(shù)設(shè)置會影響圖譜結(jié)果，測試范圍需要包含熒光特征峰波段。狹縫越窄，靈敏度越低;狹縫太大則分辨率隨之降低，同時狹縫雜散光更容易進(jìn)入。激發(fā)狹縫（Ex Slit）越大熒光強(qiáng)度越弱，發(fā)射狹縫（Em Slit）越大熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。最終選擇三維熒光光譜測試條件為：激發(fā)波長（Ex）范圍250～450 nm，采樣間隔10 nm，Ex Slit 2 nm;發(fā)射波長（Em）范圍250～600 nm，采樣間隔10 nm，Em Slit 2 nm;積分時間0.2 s。

2.2? 溶液的制備

枸杞子樣品于60 ℃烘干至恒重，粉碎后過65目篩，準(zhǔn)確稱取0.4 g粉末置于試管中，加入20 mL蒸餾水，40 ℃超聲（功率240 W，頻率40 kHz）30 min，抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，以超純水定容，得到每毫升相當(dāng)于4 mg藥材的水提液，作為母液（濃度4.00 mg/mL），用時適當(dāng)稀釋。

將0.04 mol/L磷酸、硼酸和醋酸的混合液，加入0.2 mol/L NaOH溶液，在酸度計上調(diào)至所需pH值，配制成pH 2～12的系列Britton-Robinson緩沖溶液。

2.3? 枸杞子水提部位光譜信息

枸杞子水提部位的三維熒光等高線光譜見圖1，圖中等高線表示熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，枸杞子水提部位在Ex 280 nm/Em 340 nm與Ex 340 nm/Em 450 nm處有2個熒光峰，分別標(biāo)記為Peak1、Peak2。枸杞子水提部位紫外吸收光譜見圖2，在200～350 nm范圍內(nèi)均有吸收，在波長260 nm處有吸收峰值。

通過選擇合適的激發(fā)波長和發(fā)射波長，分別繪制Peak1、Peak2對應(yīng)的枸杞子水提部位2種主要熒光組分的二維熒光光譜。組分A和組分B的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分別見圖3、圖4。

2.4? 影響因素考察

2.4.1? 濃度對熒光強(qiáng)度的影響

根據(jù)熒光分析的一般規(guī)律，稀溶液中熒光強(qiáng)度和熒光物質(zhì)的濃度成正比，熒光物質(zhì)濃度較大時會發(fā)生自猝滅，使熒光強(qiáng)度降低。將新制的枸杞子母液配制成不同濃度（0、0.004、0.008、0.012、0.04、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg /mL），在Ex 340 nm/Em 450 nm處測定熒光強(qiáng)度，考察濃度對體系熒光強(qiáng)度的影響。不同濃度枸杞子水提液三維熒光等高線光譜見圖5。可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，Peak1、Peak2熒光強(qiáng)度隨濃度升高而升高，濃度較小時水拉曼峰明顯干擾Peak1，濃度為0.4 mg/mL時2個熒光峰強(qiáng)度相當(dāng)、等高線疏密適中，故選擇0.4 mg/mL作為考察濃度。不同濃度枸杞子水提液紫外吸收光譜見圖6。紫外吸收隨濃度升高而增大，很多物質(zhì)在此波段有吸收，波長260 nm處吸收峰特征性不強(qiáng)。對比圖5和圖6可以看出，三維熒光光譜可以提供更多特征性的光譜信息。在0.1～0.8 mg/mL范圍內(nèi)，Peak1、Peak2對應(yīng)的熒光組分A、組分B的熒光強(qiáng)度隨濃度升高而升高，見圖7、圖8。

2.4.2? 放置時間對熒光強(qiáng)度的影響

新配制枸杞子水提液，考察放置時間對體系熒光強(qiáng)度的影響。于4 mL比色管中加入0.4 mL母液，用超純水配制成0.4 mg/mL溶液，平行配制3份，在48 h內(nèi)間隔一定時間測試，記錄Ex 340 nm/Em 450 nm的熒光強(qiáng)度，結(jié)果枸杞子水提液熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，在48 h內(nèi)變化很小，見表1。

2.4.3? 溫度對熒光強(qiáng)度的影響

通常溫度對溶液的熒光強(qiáng)度有顯著影響。由于分子運動和能量轉(zhuǎn)換，一般規(guī)律是，隨著溫度升高，溶液的熒光強(qiáng)度會降低。于4 mL比色管中加入0.4 mL母液，用超純水配制成0.4 mg/mL溶液，平行配制3份，在不同溫度進(jìn)行測試，記錄Ex 340 nm/Em 450 nm的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖9。

2.4.4? pH值對熒光強(qiáng)度的影響

熒光組分大多數(shù)是含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物，溶液pH值對熒光強(qiáng)度有很大影響。于10 mL容量瓶中加入1 mL母液，然后用pH 2～12的Britton- Robinson緩沖溶液定容，平行配制3份，考察溶液pH值對體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖10。

2.4.5? 共存物對熒光強(qiáng)度的影響

在枸杞子水提液中加入高濃度葡萄糖、果糖、HSO3-、Cd2+、Cu2+、Pb2+、Hg+后定容到枸杞子水提液濃度為0.4 mg/mL，考察共存物對體系熒光的影響。結(jié)果表明，葡萄糖、果糖、HSO3-、Cd2+、Cu2+等離子均對枸杞子水提液三維熒光光譜熒光峰無明顯影響，不干擾測定。含Pb2+枸杞子水提液的三維熒光光譜熒光峰紅移，熒光強(qiáng)度減弱;含Hg+枸杞子水提液的三維熒光光譜熒光強(qiáng)度減弱，峰形不變。

2.5? 熒光峰初步推斷

已有文獻(xiàn)報道東莨菪內(nèi)酯、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸熒光峰值[13-15]，故測試這些對照品的三維熒光光譜，見圖11。氨酸類在Ex 250～300 nm/Em 300～350 nm左右出峰，與水提部位特征熒光峰Peak1接近;東莨菪內(nèi)酯光譜峰在Ex 340 nm/Em 450 nm左右，與水提部位特征熒光峰Peak2相似。東莨菪內(nèi)酯和色氨酸混合三維熒光光譜峰與枸杞子水提部位特征熒光峰相似，見圖12。

3? 討論

枸杞子藥用歷史悠久，傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別以色紅、粒大、籽小、肉厚、質(zhì)柔、味甜者為佳，運用現(xiàn)代分析技術(shù)可對枸杞子進(jìn)行更全面評價。枸杞子化學(xué)成分復(fù)雜，本研究結(jié)合多維光譜的方法，發(fā)現(xiàn)其三維熒光光譜圖中只出現(xiàn)2種組分的熒光峰，可用于枸杞子的定性鑒別，初步推測其中一組為以色氨酸為代表的氨基酸類組分的特征熒光峰，另一組為東莨菪內(nèi)酯類組分的特征熒光峰。枸杞子水提部位熒光穩(wěn)定性好，不易受離子干擾，2種組分的熒光發(fā)射峰相距110 nm，選擇合適的測量波長可以分別繪制2種組分的二維熒光光譜。在實驗條件一定時，2種組分的熒光強(qiáng)度均與濃度呈良好的線性關(guān)系，可作為2種組分定量分析的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：249.

[2] LI H Y， RUAN Y W， KAU P W， et al. Effect of Lycium barbarum （Wolfberry） on alleviating axonal degeneration after partial optic nerve transection[J]. Cell Transplantation，2015，24（3）：403.

[3] SUN Y， RUKEYA J， TAO W， et al. Bioactive compounds and antioxidant activity of wolfberry infusion[J]. Scientific Reports，2017，7：40605.

[4] AMAGASE H， FARNSWORTH N R. A review of botanical characteristics， phytochemistry， clinical relevance in efficacy and safety of Lycium barbarum， fruit （Goji）[J]. Food Research International，2011，44（7）：1702-1717.

[5] 李媛媛，亓翠玲，周芷晴，等.枸杞多糖對自發(fā)乳腺癌MMTV-PyMT小鼠腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用[J].中國實驗動物學(xué)報，2016，24（6）：618-621.

[6] YOUN U J， KIL Y S， NAM J W， et al. New pyrrole alkaloids with bulky N-alkyl side chains containing stereogenic centers from Lycium chinense[J]. Helvetica Chimica Acta，2013，96（8）：1482- 1487.

[7] KAI G， MA D， YAN C， et al. Three new dimers and two monomers of phenolic amides from the fruits of Lycium barbarum and their antioxidant activities[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2015，63（4）：1067-1075.

[8] YI R， LIU X M， DONG Q. A study of Lycium barbarum polysaccharides （LBP） extraction technology and its anti-aging effect[J]. African Journal of Traditional Complementary & Alternative Medicines， 2013，10（4）：171.

[9] 湯麗華，劉敦華.基于近紅外光譜技術(shù)的枸杞產(chǎn)地溯源研究[J].食品科學(xué)，2011，32（22）：175-178.

[10] 廖國玲，張自萍，郭榮.寧夏枸杞甜菜堿提取物高效液相色譜指紋圖譜研究[J].分析科學(xué)學(xué)報，2007，23（6）：642-646.

[11] 李小亭，李瑞盈，相海恩，等.基于HPLC指紋圖譜及聚類分析對不同產(chǎn)地枸杞質(zhì)量評價研究[J].現(xiàn)代食品科技，2012，28（9）：1251-1253.

[12] 陳開娟.不同等級枸杞中枸杞多糖的含量測定與比較[J].海峽藥學(xué)， 2011，23（8）：100-102.

[13] 白雪梅，田嘉銘，王德寶.高效液相色譜法測定枸杞子中氨基酸的含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2005，16（8）：742-743.

[14] 趙方方.幾種非芳香族氨基酸熒光性質(zhì)及其影響因素的研究[D].秦皇島：河北科技師范學(xué)院，2015.

[15] 易智彪，曾寶，賴小平.HPLC法測定枸杞中的東莨菪內(nèi)酯含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6（4）：13-15.