李希凡　陳恬　方方

【摘 要】孤獨癥作為一種廣泛性發(fā)育障礙的代表性疾病，通常在2-4歲就能診斷出，關于孤獨癥的發(fā)病機制有很多假說，但目前確切發(fā)病機制仍尚未闡明。由于發(fā)病機制的不確定，因此目前尚未有效治療方法。miRNA作為其他領域的研究熱點，在孤獨癥中研究的并不多，因此，研究孤獨癥中miRNA的變化將有可能揭示孤獨癥的發(fā)病機制。

【關鍵詞】孤獨癥;miRNA;動物模型

中圖分類號： R749.94文獻標識碼： A文章編號： 2095-2457（2019）10-0197-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.10.086

孤獨癥（Autism）是一種廣泛性發(fā)育障礙的代表性疾病，主要表現(xiàn)為社會交流障礙、語言交流障礙以及重復刻板行為三大核心臨床癥狀[1]。據(jù)2014年柳葉刀發(fā)布的一份統(tǒng)計調(diào)查表明，世界范圍內(nèi)的孤獨癥患者約為總人口的1%[2]，而這個比例隨著人們對孤獨癥認識的加深在不斷升高。雖然孤獨癥在2-4歲就能診斷出，但由于目前尚未有效的治療方法，因此孤獨癥的核心癥狀往往伴隨終生，嚴重危害了患者的正常生活，給患者、家庭及社會造成極大困擾。

目前，孤獨癥發(fā)病的原因尚不清楚，普遍認為是胚胎發(fā)育時神經(jīng)發(fā)育期環(huán)境和遺傳因素共同作用的結果[1-3]，因此，孤獨癥的動物模型通常也分這兩種[1]，其中，環(huán)境因素的有丙戊酸鈉（Valproic acid， VPA）暴露模型、沙利度胺（Thalidomide， THAL）暴露模型以及母體免疫激活模型等;基因遺傳有MeCP2、EN2以及15q11-13染色體異常模型等，我國的仇子龍團隊于2016年在全球范圍內(nèi)首次建立了MeCP2基因的非人靈長類動物模型[4]，被評為2016年度“中國生命科學領域十大進展”。由于我們更為關心胚胎發(fā)育時環(huán)境因素所導致的孤獨癥，因此，本研究擬采用VPA暴露模型。早在1991年就有報道指出孕期使用VPA會使子代出現(xiàn)孤獨癥病癥[5]，這是因為在神經(jīng)管關閉和第一批神經(jīng)元發(fā)育時（人類胚胎發(fā)育第20-24天，嚙齒目為12-13天），VPA的使用會使這些神經(jīng)元及其對應的腦神經(jīng)核團的發(fā)育出現(xiàn)紊亂，如抑制神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育及遷移、神經(jīng)元過度增殖導致低分化[6]等。在嚙齒目中使用VPA造孤獨癥模型進行研究由來已久[7]，Wistar大鼠[8]、SD大鼠[9]、C57小鼠[10]、DBA小鼠[11]、CF-1小鼠[11]以及ICR小鼠[12]上均被報道使用，是非常成熟的造模方法，本研究擬采用C57小鼠來造VPA孤獨癥模型。

孤獨癥的發(fā)生具有廣泛的生物學基礎，目前研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，孤獨癥患者從腦形態(tài)、腦功能、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)免疫、氧化應激、遺傳學以及突觸可塑性等方面均有改變。在對孤獨癥患者進行回顧性研究和孤獨癥高危家族跟蹤性研究后發(fā)現(xiàn)，孤獨癥患者在出生后6-12月出現(xiàn)皮層表面積過度擴張、12-24月腦體積過度增長的現(xiàn)象[13-14]，這種早期大腦發(fā)育過度通常發(fā)生在前額葉皮層（Prefrontal cortex， PFC），且前額神經(jīng)元的數(shù)量與腦重量均顯著增加[15]。隨著年紀增加，孤獨癥患者的腦圍會逐漸恢復到正常水平，在對其腦部進行檢測后發(fā)現(xiàn)前額Brodmann分區(qū)中的BA46、BA47和BA9區(qū)出現(xiàn)微清蛋白（Parvalbumin， PV）陽性中間神經(jīng)元數(shù)量的明顯減少，這或許解釋了后期腦圍的恢復正常，由于這種中間神經(jīng)元能通過對神經(jīng)元胞周和軸突的抑制進而使錐體細胞的活動同步[16]，因此，它的減少直接導致了自閉癥患者大腦皮層興奮/抑制的改變，這可能與孤獨癥認知和運動缺陷的出現(xiàn)有關。與這些神經(jīng)元數(shù)目改變一起出現(xiàn)的還有炎癥反應，回顧性研究表明，患者的前額葉、顳葉等腦組織中均出現(xiàn)了炎性因子如IL-6、TNF-α的顯著升高以及小膠質(zhì)細胞的顯著增多[17]，炎性因子的釋放會進一步加劇炎性狀況造成惡性循環(huán)。此外，一些信號通路也發(fā)生異常變化，如調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞增殖、分化、遷移、凋亡以及突觸形成與聯(lián)系的經(jīng)典Wnt信號通路[18-19]。有研究指出，在VPA暴露的孤獨癥大鼠前額葉皮層和海馬組織中GSK-3β（Ser9）磷酸化水平顯著增加，其負調(diào)控底物β-catenin磷酸化水平顯著降低從而減少β-catenin被泛素標記進入蛋白降解途徑，β-catenin的增加說明經(jīng)典Wnt信號通路被激活[18-20]。由于Wnt信號通路能影響神經(jīng)元正常發(fā)育以及突觸的生長與成熟[21-22]，阻礙正常神經(jīng)網(wǎng)絡的形成，最終導致了孤獨癥患者三大核心臨床癥狀的出現(xiàn)[23]。有些研究針對孤獨癥發(fā)生的上述生物學基礎進行孕鼠的預處理，如使用吲哚美辛來抑制炎癥的發(fā)生[24]、使用維生素D來提高孕鼠免疫力減少炎性因子的釋放[25]、使用Sulindac抑制Wnt/β-catenin通路[26]等，這些措施雖然都能不同程度的改善子代的癥狀，如痛閾相對正常、刻板重復動作減少、提高學習和記憶能力等，但針對已出現(xiàn)癥狀的子代，迄今為止尚無特異性治療藥物。目前對患者多采用行為干預為主、藥物治療為輔的綜合性治療措施，美國FDA只批準了利培酮（risperidone）及阿立哌唑（aripiprazole）這兩種抗精神病藥用于改善患者的易怒、攻擊及刻板行為。由于孤獨癥的確切發(fā)病機制尚未闡明，因此加強對孤獨癥病因學的研究、在病因學研究的基礎上找到合適的藥物靶標并進行驗證就顯得尤為重要[27]。

美國加州大學Daniel Geschwind團隊分別在2011年、2016年8月以及2016年12月對孤獨癥患者以及正常人的腦部尸檢標本進行了轉錄組水平[28]、miRNA水平[29]以及l(fā)ncRNA水平[30]的高通量分析，北京大學的王力芳團隊也于2017年啟動了孤獨癥相關miRNA的遺傳篩選及其調(diào)控機制的自然基金面上項目研究，這都標志著對孤獨癥的研究已進入了高通量分析及之后的數(shù)據(jù)挖掘以及尋找關鍵基因的階段。miRNA是一類長度約為20-24個核苷酸的小RNA，每個miRNA可以有多個靶基因，而多個miRNA也可以調(diào)節(jié)同一個基因從而形成復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡。miRNA這種復雜而又精細的調(diào)節(jié)機制使得其成為很有希望的治療藥物或藥物治療的靶點，如正在進行Ⅰ期臨床的針對miR-16研發(fā)的MRG-201、已通過Ⅰ期并進入Ⅱa期臨床的針對miR-122的Miravirsen[31]。

雖然miRNA在其它領域研究的如火如荼，但在孤獨癥方面，關于miRNA的研究才起步不久。我們有理由相信，miRNA有望成為孤獨癥研究的熱點。

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